表達載體的構建方法及步驟

1、.表達載體的構建方法及步驟一、載體的選擇及如何閱讀質粒圖譜 目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質粒 DNA 是一種新的非病毒轉基因載體。一個合格質粒的組成要素：（1）復制起始位點 Ori 即控制復制起始的位點。原核生物 DNA 分子中只有一個復制起始點。而真核生物 DNA 分子有多個復制起始位點。（2）抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位點 MCS 克隆攜帶外源基因片段（4） P/E 啟動子/增強子（5）Terms 終止信號（6）加 poly（A）信號可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用選擇載體主要依據(jù)構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建

2、的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。載體選擇主要考慮下述3點：【1】構建 DNA 重組體的目的，克隆擴增/基因表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。【2】.載體的類型：（1）克隆載體的克隆能力據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選?。Ｈ?0kb 選質粒。（2）表達載體據(jù)受體細胞類型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。（3）對原核表達載體應該注意：選擇合適的啟動子及相應的受體菌，用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考?！?】載體 MCS 中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不能產(chǎn)生閱讀框

3、架錯位。綜上所述，選用質粒（最常用）做載體的5點要求：（1）選分子量小的質粒，即小載體（11.5kb）不易損壞，在細菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；（2）一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般 10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒10個。（3）必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；（4）必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。（5）滿足自己的實驗需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標記，是否需要加入標簽蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進行切割，獲得線性載體分

4、子，以便于與目的基因片段進行連接。如何閱讀質粒圖譜第一步：首先看 Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。（1）Ampr 水解內酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞。（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶使 G418（長那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素失活。第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點以外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因

5、以及如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子核糖體結合位點克隆位點轉錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體?？寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。第六步：啟動子核糖體結合位點克隆位點轉錄終止信號（1）啟動子促進 DNA 轉錄的 DNA 序列，這個 DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位，但

6、啟動子本身不被轉錄。（2）增強子/沉默子為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子負增強子，負調控序列。（3）核糖體結合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。（4）轉錄終止序列（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA的保守序列，此位點 downstream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構成 poly（A）加尾信號。結構基因的最后一個

7、外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 downstream 有一段GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構成 poly（A）加尾信號。質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA 鏈，即質粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上 .根據(jù)表達宿主不同，構建時所選擇的載體也會不同。二、目的基因的獲得 一般來說，目的基因的獲得有三種途徑：調取基因：根據(jù)目的基因的序列，設計引物從含有目的基因的cDNA中通過PCR的方法調取目的基因，鏈接到克隆載體挑取單克隆進行測序，以獲得想要的基因片段，這種方法相對成本較低，但是調取到的基因往往含有突變，還

8、有不同基因的表達豐度不同，轉錄本比較復雜，或是基因片段很長，這些情況都很難調取到目的基因。全基因合成：根據(jù)目的基因的DNA序列，直接設計合成目的基因。此方法準確性高，相對成本會高一些，個人操作比較困難，需要專業(yè)的合成公司完成。優(yōu)點是可以合成難調取及人工改造的任何基因序列，同時可以進行密碼子優(yōu)化，提高目的基因在宿主內的表達量。三、克隆構建 目前，克隆構建的方法多種多樣，除了應用廣泛的酶切鏈接以外，現(xiàn)在還有很多不依賴酶切位點的克隆構建方式。下面具體說一下雙酶切方法構建載體的步驟。實驗材料實驗試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家載體pCDNA3.1Transheep大腸桿菌菌株DH5Tiangen 限制性內切酶Fe

9、rmentasT4連接酶Fermentas質粒DNA小,大量抽提試劑盒Axygen 凝膠回收試劑盒Axygen瓊脂糖BiowestDNA ladderFermentas（2）X基因慢病毒載體的構建X基因基因由Transheep全基因合成，構建于載體PUC57中。PUC57-X基因 EcoRI/BamHI酶切結果：酶切完成后進行膠回收2. 載體用pCDNA3.1雙酶切，酶切體系如下。20ul酶切體系 37度3小時4ul pCDNA3.1載體（500 ng/ul）1ul BamHI1ul EcoRI2ul 10buffer 12 ul H2O酶切完成后膠回收（見附錄）處理好的目的片段與載體連接反應體系：6ul PCR 酶切回收片段（約50ng/ul）1ul 酶切好的載體（約50ng/ul）2ul ligase buffer1ul T4ligase10ul H2O以上連接液在16過夜。轉化 (感受態(tài)細