小動(dòng)物活體成像技術(shù)的原理及操作方法

1、小動(dòng)物活體成像技術(shù)的原理及操作方法活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光就是用熒光素酶基因(luciferase)標(biāo)記細(xì)胞或dna, 而熒光技術(shù)則采用綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等熒光報(bào)告基因與fitc 、cy5 、cy7 等熒光素及量子點(diǎn)(quantumdot,qd)進(jìn)行標(biāo)記。小動(dòng)物活體成像技術(shù)就是采用高靈敏度制冷ccd 配合特制的成像暗箱與圖像處理軟件, 使得可以直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)與基因行為。實(shí)驗(yàn)者借此可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。由于具有更高量子效率ccd 的問世 , 使活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)具有越

2、來越高的靈敏度, 對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高; 另外 , 該技術(shù)不涉及放射性物質(zhì)與方法, 非常安全。 因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來的幾年時(shí)間內(nèi), 已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。一、小動(dòng)物活體成像概述1 、 熒光發(fā)光成像熒光成像的標(biāo)記對(duì)象較為廣泛, 可以就是動(dòng)物、細(xì)胞、微生物、基因, 也可以就是抗體、藥物、納米材料等。常用的有綠色熒光蛋白 (gfp) 、紅色熒光蛋白 (dsred)及其它熒光報(bào)告基團(tuán), 標(biāo)記方法與體外熒光成像相似 , 熒光成像具有費(fèi)用低廉與操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似, 紅光的穿透性在體內(nèi)

3、比藍(lán)綠光的穿透性效率高, 近紅外熒光為成像觀察的最佳選擇。雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光, 但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光, 但就是受到熒光特性的限制, 很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。盡管目前大部分高水平的文章還就是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。但就是, 熒光成像有其方便 , 直觀 , 標(biāo)記靶點(diǎn)多樣與易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn), 在一些植物分子生物學(xué)研究與觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究, 可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求, 選擇合適的方法。例如利用綠色熒光蛋白與熒光素酶對(duì)細(xì)胞

4、或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記, 用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè), 進(jìn)行分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究, 然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè), 進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。熒光發(fā)光就是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài), 而后產(chǎn)生發(fā)射光。考慮到不同熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜 ex(excitationspectrum)與激發(fā)光譜 em(emission8pectrum)的不同 , 要選擇對(duì)應(yīng)的激發(fā)與發(fā)射濾片。常用熒光蛋白與熒光染料的激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)見表1 。ex(mem(mm)表 1常用熒光蛋白與熒光染料的激發(fā)與m)發(fā)射波長(zhǎng)gfp480520dsred/r530600fpcy5630680cy5 、 5630700小動(dòng)

5、物活體成像技術(shù)的原理及操作方法ex(mem(mm)表 1常用熒光蛋白與熒光染料的激發(fā)與m)發(fā)射波長(zhǎng)cy77007802 、 生物發(fā)光成像活體生物熒光成像技術(shù)就是指在小的哺乳動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因- 熒光素酶基因表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、mg 2+ 離子存在的條件下消耗 atp 發(fā)生氧化反應(yīng) , 將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫?。然后在體外利用敏感的ccd 設(shè)備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動(dòng)子, 成為某種基因的報(bào)告基因 , 通過監(jiān)測(cè)報(bào)告基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的監(jiān)測(cè)。生物熒光實(shí)質(zhì)就是一種化學(xué)熒光, 螢火蟲熒光素酶在氧化其特有底物熒光素的過程中可以釋放波長(zhǎng)廣泛的可

6、見光光子 , 其平均波長(zhǎng)為 560 nm(460 630 nm), 這其中包括重要的波長(zhǎng)超過600 nm的紅光成分。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白就是吸收可見光的主要成分, 能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見光; 水與脂質(zhì)主要吸收紅外線 , 但其均對(duì)波長(zhǎng)為590 800 nm 的紅光至近紅外線吸收能力較差,因此波長(zhǎng)超過 600 nm 的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織被高靈敏的ccd 檢測(cè)到。生物發(fā)光成像的優(yōu)點(diǎn)可以非侵入性, 實(shí)時(shí)連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)的各種生物學(xué)過程, 從而可以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量 , 及降低個(gè)體間差異的影響 ; 由于背景噪聲低 , 所以具有較高的敏感性 ; 不需要外源性激發(fā)光

7、, 避免對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞造成損傷 , 有利于長(zhǎng)期觀察 ; 此外還有無放射性等其她優(yōu)點(diǎn)。然而生物發(fā)光也有自身的不足之處: 例如波長(zhǎng)依賴性的組織穿透能力,光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射與吸收 , 光子遇到細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射 , 而且不同類型的細(xì)胞與組織吸收光子的特性也不盡相同 , 其中血紅蛋白就是吸收光子的主要物質(zhì) ; 由于就是在體外檢測(cè)體內(nèi)發(fā)出的信號(hào) , 因而受到體內(nèi)發(fā)光源位置及深度影響; 另外還需要外源性提供各種熒光素酶的底物,且底物在體內(nèi)的分布與藥動(dòng)力學(xué)也會(huì)影響信號(hào)的產(chǎn)生 ; 由于熒光素酶催化的生化反應(yīng)需要氧氣、 鎂離子及 atp 等物質(zhì)的參與 , 受到體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)的影響。二、小動(dòng)物

8、活體成像1 、 制作動(dòng)物模型可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要通過尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標(biāo)記的細(xì)胞或組織。在建模時(shí)應(yīng)認(rèn)真考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c選擇熒光標(biāo)記 , 如標(biāo)記熒光波長(zhǎng)短 , 則穿透效率不高 , 建模時(shí)不宜接種深部臟器與觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)移 , 但可以觀察皮下瘤與解剖后臟器直接成像。深部臟器與體內(nèi)轉(zhuǎn)移的觀察大多選用熒光素酶標(biāo)記。2 、 活體成像小鼠經(jīng)過常規(guī)麻醉( 氣麻、針麻皆可) 后放入成像暗箱平臺(tái), 軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野,自動(dòng)開啟照明燈 ( 明場(chǎng) ) 拍攝第一次背景圖。下一步, 自動(dòng)關(guān)閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下( 暗場(chǎng) ) 拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異光子。明場(chǎng)與暗場(chǎng)的背景圖疊加后可

9、以直觀的顯示動(dòng)物體內(nèi)特異光子的部位與強(qiáng)度完成成像操作。值得注意的就是熒光成像應(yīng)選擇合適的激發(fā)與發(fā)射濾片, 生物發(fā)光則需要成像前體內(nèi)注射底物激發(fā)發(fā)光。,3 、 數(shù)據(jù)處理小動(dòng)物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強(qiáng)度標(biāo)尺的成像圖片外, 還能計(jì)算分析發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強(qiáng)度的相關(guān)參數(shù)供實(shí)驗(yàn)者參考。小動(dòng)物活體成像技術(shù)的原理及操作方法4 、 實(shí)驗(yàn)影響因素原則上 , 如預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)拍攝出圖片非特異性雜點(diǎn)多 , 需降低曝光時(shí)間 ; 反之 , 如信號(hào)過弱可適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間。但曝光時(shí)間的延長(zhǎng) , 不僅增加了目的信號(hào) , 對(duì)于背景噪音也存在一個(gè)放大效應(yīng)。同一批實(shí)驗(yàn)應(yīng)保持一致的曝光時(shí)間 , 同時(shí)還應(yīng)保持標(biāo)本相對(duì)位置

10、與形態(tài)的一致, 從而減少實(shí)驗(yàn)誤差。進(jìn)行熒光成像時(shí) , 實(shí)驗(yàn)者可選擇背景熒光低不容易反光的黑紙放在動(dòng)物標(biāo)本身下, 減少金屬載物臺(tái)的反射干擾。動(dòng)物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后, 會(huì)發(fā)出熒光 , 產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度。背景熒光主要就是來源于皮毛與血液的自發(fā)熒光, 皮毛中的黑色素就是皮毛中主要的自發(fā)熒光源, 其發(fā)光光線波長(zhǎng)峰值在 500 一 520nm 左右 , 在利用綠色熒光作為成像對(duì)象時(shí), 影響最為嚴(yán)重 , 產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度與特異性。動(dòng)物尿液或其她雜質(zhì)如沒有及時(shí)清除, 成像中也會(huì)出現(xiàn)非特異性信號(hào)。由于各廠商的圖像分析軟件不同, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法也有區(qū)別。活體成像系統(tǒng)使用時(shí), 實(shí)驗(yàn)者考慮到非特異性雜信號(hào) , 以及成像圖片美觀等方面 , 可能會(huì)調(diào)節(jié)信號(hào)的閾值 , 因此在分析信號(hào)光子數(shù)或信號(hào)面積時(shí), 應(yīng)考慮閾值的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。正確選擇roi 區(qū)域 , 可提高分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。三、展望小動(dòng)物活體成像技術(shù)具有靈敏度高、直觀、操作簡(jiǎn)單、能同時(shí)觀測(cè)多個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本, 相比 pet