實(shí)驗(yàn)二_____土壤中放線菌的分離

1、實(shí)驗(yàn)講義5 土壤中枯草芽孢桿菌分離方法取土樣時(shí)最好選取如花壇等地方的土樣，去掉表層510cm的土壤后取樣。 放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常壓加熱至水沸騰后維持20min，取出，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，液面則產(chǎn)生黃白色皮膜。用接種環(huán)取皮膜適量于無菌水中分散，稀釋涂布于蔗糖豆芽汁瓊脂平皿，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，挑取典型菌落。實(shí)驗(yàn)6 土壤中放線菌的分離（實(shí)訓(xùn)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。2掌握稀釋倒平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。3掌握平板劃線法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。4掌握涂布平板法從土壤中分離放線菌的基本原

2、理和基本操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)材料：藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、瓊脂。其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。實(shí)驗(yàn)原理：高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用化學(xué)成分完全了解的純?cè)噭┡渲贫傻呐囵B(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3 、NaCl 、K2HPO43H2O 、MgSO47H2O 作為無機(jī)鹽，F(xiàn)eSO47H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成。放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布

3、在土壤中，其數(shù)量僅次于細(xì)菌，一般在中性偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細(xì)菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。實(shí)驗(yàn)步驟：1.高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基的制備高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基（培

4、養(yǎng)放線菌用） 可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 3H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。112滅菌20分鐘。2. 土壤中放線菌的分離（1）待測樣液的制備選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地），按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取210cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回

5、后應(yīng)盡快投入實(shí)驗(yàn)。稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩1020min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無菌水的試管3支，編號(hào)10-3、10-4、10-5。用無菌吸管無菌操作取10-2濃度的土壤懸液1ml并加入編號(hào)10-3的無菌試管中，并吹吸吸管23次，使與9ml水混勻，即為10-3濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個(gè)稀釋度換1支無菌吸管）。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進(jìn)行。（2）稀釋倒平板法分離土壤中放線菌取2支1毫升移液管分別從10-5、10-4菌懸液中吸取1毫升菌懸液

6、，分別注入編號(hào)10-5、10-4的培養(yǎng)皿內(nèi)。將溫度為4550的高氏一號(hào)培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。（3）涂布平板法分離土壤中放線菌取2套無菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-4、10-5）、組別、姓名、操作日期等。每個(gè)稀釋度做一個(gè)培養(yǎng)皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50左右的高氏一號(hào)培養(yǎng)基1520ml左右，待冷凝成平板。用無菌吸管從濃度最小稀釋液開始，每次吸取0.1ml加到一組相應(yīng)編號(hào)（10-5）的高氏一號(hào)平板上（每次吸取前，吸管要在液體內(nèi)吹吸幾次），再依次將10-4的

7、土壤稀釋液加到相應(yīng)平板上。用無菌刮棒（從濃度小的稀釋液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻。（4）平板劃線法分離土壤中放線菌 取一培養(yǎng)皿置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，左手將培養(yǎng)皿打開稍許，向培養(yǎng)皿內(nèi)注入熔化的營養(yǎng)固體培養(yǎng)基1012毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個(gè)區(qū)。每組兩個(gè)平板培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許10-2濃度的土壤稀釋液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 67條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70角，用燒過冷卻的接種針，通

8、過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。（5）培養(yǎng)接種完畢，將平皿放入28恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。（6）挑菌落待三種方法的平板長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)。轉(zhuǎn)種至斜面，菌種用牛皮紙包好，置4冰箱中保存。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：問曾老師借 無菌刮棒 打火機(jī) 酒精燈無菌報(bào)紙包（1個(gè)） 99mL水/三角瓶（玻璃珠） 5支移液管3支9mL水的試管 培養(yǎng)皿6套槍頭（1mL/0.1mL）高氏一號(hào)培養(yǎng)基500mL（150mL三角瓶2個(gè)，200mL試管）思考題：1.檢查接種后培養(yǎng)物的生長情況和染菌情況。 2.觀察與記錄以下內(nèi)容。 大小 形狀 邊緣顏色 表面代謝物 種類3.如何區(qū)分放線菌和真菌、細(xì)菌？放線菌菌落小而緊密、干燥、不透明、難以挑取，當(dāng)大量孢子覆蓋于菌落表面時(shí)，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，由于基內(nèi)菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現(xiàn)出不同的色澤。霉菌菌落的話應(yīng)該是比較大的，可能是大而疏松也可能大而