第10章 吸光光度法.ppt

1、第10章 吸光光度法,10.1 概述 10.2 吸光光度法基本原理 10.3 分光光度計(jì) 10.4 顯色反應(yīng)及影響因素 10.5 光度分析法的設(shè)計(jì) 10.6 吸光光度法的誤差 10.7 常用的吸光光度法 10.8 吸光光度法的應(yīng)用,吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法 基于外層電子躍遷,10.1 概述,吸收光譜 發(fā)射光譜 散射光譜,分子光譜 原子光譜,10.2 吸光光度法基本原理,1 吸收光譜產(chǎn)生的原因 光:一種電磁波,波粒二象性,當(dāng)光子的能量與分子的E匹配時(shí)，就會(huì)吸收光子 E=hu=hc/l,a 躍遷類(lèi)型 價(jià)電子躍遷：*, *; n*, n* E (h)

2、 順序: n* n*,有機(jī)化合物的生色原理,b 生色團(tuán)和助色團(tuán) 生色團(tuán): 含有*躍遷的不飽和基團(tuán) 助色團(tuán): 含非鍵電子的雜原子基團(tuán),如-NH2, -OH, -CH3 與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使吸收峰紅移，吸收強(qiáng)度增強(qiáng),2 物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系,互補(bǔ)色,吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收光的強(qiáng)度大小 Al關(guān)系 最大吸收波長(zhǎng) lmax：光吸收最大處的波長(zhǎng),3 一些基本名詞和概念,lmax,對(duì)比度(l):絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)(lMRmax)與試劑最大吸收波(lRmax)之差,l,原子光譜為線光譜 分子光譜為帶光譜,電子躍遷能級(jí) 分子振動(dòng)能級(jí) 分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí),4 朗伯-比爾定律,光吸收定律朗伯-比爾(Lamb

3、ert-Beer)定律 吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律,I0 = Ir + It + Ia,I0 = It + Ia,T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg (I0 / It )lg(1/T), A:吸光度,朗伯定律（1760年）：光吸收與溶液層厚度成正比 比爾定律（1852年）：光吸收與溶液濃度成正比,當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系朗伯比爾定律 光吸收定律 數(shù)學(xué)表達(dá)：Alg(1/T)=Kbc 其中，A:吸光度，T:透射比， K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度,注意： 平行單色光 均相介質(zhì) 無(wú)

4、發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng),摩爾吸光系數(shù) e,靈敏度表示方法,A = e bc,A = Kbc,c: mol/L,e 表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。單位： (Lmol-1 cm-1),c: g/L,A = abc a: 吸光系數(shù),桑德?tīng)?Sandell)靈敏度： S 當(dāng)儀器檢測(cè)吸光度為0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)到的吸光物質(zhì)的最低含量。 單位：mg/cm2 S=M/e,氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮 50ml容量瓶中有Nb30g，用2cm比色池，在650nm測(cè)定光吸收，A0.43,求S. (Nb原子量92.91)。 有兩種做法：根據(jù)A=bC,求,3.3104 Lmo

5、l-1cm-1,吸光度的加和性,A1 = e1bc1 A2 = e2bc2 A = e1bc1+ e2bc2,根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行多組分的測(cè)定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)定,在某一波長(zhǎng)，溶液中含有對(duì)該波長(zhǎng)的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個(gè)吸光物質(zhì)的吸光度之和,1 分光光度計(jì)的組成,10.3 吸光光度計(jì),常用光源,單色器 作用:產(chǎn)生單色光 常用的單色器：棱鏡和光柵,樣品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5cm 材質(zhì)：玻璃比色皿可見(jiàn)光區(qū) 石英比色皿可見(jiàn)、紫外光區(qū),檢測(cè)器 作用：接收透射光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào) 常用檢測(cè)器： 光電管 光電倍增管

6、光二極管陣列,光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用6251000nm波長(zhǎng)；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200625nm波長(zhǎng),目視比色法比色管,光電比色法光電比色計(jì) 光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計(jì),分光光度法與分光光度計(jì),722型分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)圖,1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準(zhǔn)直鏡；6.光柵 9.比色池；10.光電管,10.4 顯色反應(yīng)及影響因素,要求： a. 選擇性好 b. 靈敏度高 (104) c. 產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定 d. 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 e. 反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別 (l60nm),沒(méi)有顏色的化合物，需要通過(guò)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化

7、合物再測(cè)定 顯色反應(yīng),1 顯色反應(yīng),絡(luò)合反應(yīng),氧化還原反應(yīng),2 顯色反應(yīng)類(lèi)型,離子締合反應(yīng),成鹽反應(yīng),褪色反應(yīng) Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸,吸附顯色反應(yīng) 達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色,3 顯色劑,無(wú)機(jī)顯色劑: 過(guò)氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀,有機(jī)顯色劑： 偶氮類(lèi)：偶氮胂III,三苯甲烷類(lèi) 三苯甲烷酸性染料 鉻天菁S,三苯甲烷堿性染料 結(jié)晶紫,鄰菲羅啉類(lèi)：新亞銅靈,肟類(lèi)：丁二肟,4 多元絡(luò)合物,混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 離子締合物 AuCl4-羅丹明B 金屬離子-配體-表面活性劑體系 Mo-水楊基熒光酮-CTMAB,5

8、 影響因素,a 溶液酸度（pH值及緩沖溶液） 影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變l 影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀 影響絡(luò)合物組成,pH對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響,b 顯色劑的用量,稍過(guò)量，處于平臺(tái)區(qū),c 顯色反應(yīng)時(shí)間,針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯示時(shí)間 顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定； 顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時(shí)間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定,d 顯色反應(yīng)溫度,加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解,e 溶劑,f 干擾離子,有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率,消除辦法： 提高酸度，加入隱蔽劑，改變價(jià)態(tài) 選擇合適參比 褪色空白(鉻天菁S測(cè)Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾) 選擇適當(dāng)波長(zhǎng),10.5 光

9、度分析法的設(shè)計(jì),1. 選擇顯色反應(yīng) 2. 選擇顯色劑 3. 優(yōu)化顯色反應(yīng)條件 4. 選擇檢測(cè)波長(zhǎng) 5. 選擇合適的濃度 6. 選擇參比溶液 7. 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)量條件選擇,1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇,選擇原則：“吸收最大，干擾最小”,靈敏度,選擇性,2 測(cè)定濃度控制,控制濃度 吸光度A：0.20.8,減少測(cè)量誤差,3 參比溶液選擇,儀器調(diào)零 消除吸收池壁和溶液對(duì)入射光的反射 扣除干擾,試劑空白 試樣空白 褪色空白,4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律,相同條件下 測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A Ac 作圖,10.6 吸光光度法的誤差,非單色光引起的偏移 物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng) 吸光度

10、測(cè)量的誤差,對(duì)朗伯-比爾定律的偏移,1 非單色光引起的偏移,復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。,非均勻介質(zhì) 膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎,2 物理化學(xué)因素,離解、締合、異構(gòu)等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42- PAR的偶氮醌腙式,化學(xué)反應(yīng),吸光度標(biāo)尺刻度不均勻,3 吸光度測(cè)量的誤差,A0.434 ，T36. 8% 時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小 A=0.20.8, T=1565%，相對(duì)誤差4%,dc/c= dA/A=dT/TlnT,

11、Er=dc/c100= dA/A100=dT/TlnT100,令ST=0.01,計(jì)算T不同值時(shí)的Sc/c，當(dāng)TlnT對(duì)T進(jìn)行微分時(shí)，其值為零時(shí)，Sc/c最小，此時(shí)T=0.368。,1.示差吸光光度法 目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度 解決高(低)濃度組分(i.e. A在0.20.8以外)問(wèn)題 分類(lèi)：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法 特點(diǎn)： 以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白 原理： A相對(duì) = A = bcx- bc0= b c 準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展, 相對(duì)誤差減少, c0愈接近c(diǎn)x, 準(zhǔn)確度提高愈顯著,10.7 常用的吸光光度法,例：硫脲還原硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸高氯酸介

12、質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）為五價(jià)，2.00mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測(cè)定樣品溶液的吸光度,480nm測(cè)定A。,2.雙波長(zhǎng)吸光光度法 目的：解決渾濁樣品光度分析 消除背景吸收的干擾 多組分同時(shí)檢測(cè) 原理： A = Al1-Al2 = （l1- l2）b c 波長(zhǎng)對(duì)的選擇： a.等吸光度點(diǎn)法，b.系數(shù)倍率法,3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法,選l1為參比波長(zhǎng), l2為測(cè)量波長(zhǎng) 得 Al1= xl1bcx + yl1bcy Al2= xl2bcx+ yl2bcy A=Al2-Al1= ( x2bcx+

13、 yl2bcy)-( xl1bcx+ yl1bcy) 在等吸光度的位置(G, F), yl2 yl1，則上式成為 A=( xl2- xl1）bcx A與cx成正比, 可用于測(cè)定,例,苯酚與2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定。,3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法,目的：提高分辨率 去除背景干擾 原理： dnA/dln l,10.8 吸光光度法的應(yīng)用,1 測(cè)定弱酸和弱堿的離解常數(shù),AHB和AB-分別為有機(jī)弱酸HB在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性時(shí)的吸光度，它們此時(shí)分別全部以HB或B-形式存在。,HB H+ + B-,pKa=pH+ lg,HB,B-,A=AHB+AB-,對(duì)pH作圖即可求得pKa,2 絡(luò)合物組成確定,飽和法（摩爾比法）,制備一系列含釕3.010-5 mol/L (固定不變)和不同濃度（小于12.010-5 mol/L）的PDT溶液，按實(shí)驗(yàn)條件，485nm測(cè)定吸光度,作圖。,PDT:Ru=2:1,等摩爾連續(xù)變化法,固定M+