生化蛋白章節(jié)復(fù)習(xí)資料

1、 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能1) 蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用：功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白具有以下幾種主要功能：1、 生物催化作用2、 代謝調(diào)節(jié)作用3、 免疫保護(hù)作用4、 物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存5、 運(yùn)動(dòng)與支持作用6、 生長(zhǎng)、繁殖、遺傳和變異作用7、 生物膜的功能和受體8、 另外，外源蛋白質(zhì)有營(yíng)養(yǎng)功能，可作為生產(chǎn)加工的對(duì)象2) 蛋白質(zhì)的組成（元素組成、化學(xué)組成）及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定一、蛋白質(zhì)的元素組成 蛋白質(zhì)是一類(lèi)含氮有機(jī)化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳50，氫 7，氧 23，氮 16%，硫 03，其他 微量二、蛋

2、白質(zhì)的含量測(cè)定 蛋白質(zhì)中的氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的大概含量。這是凱氏（Kjadehl） 定氮法的理論基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)的含量=蛋白質(zhì)含氮量100/16 =蛋白質(zhì)含氮量6.25 3) 二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類(lèi)及名稱（三字縮寫(xiě)符、單字縮寫(xiě)符） 根據(jù)R側(cè)鏈基團(tuán)解離性質(zhì)的不同，可將氨基酸進(jìn)行分類(lèi)： 1.酸性氨基酸Glu，Asp；側(cè)鏈基團(tuán)在中性溶液中解離后帶負(fù)電荷的氨基酸。 2.堿性氨基酸His，Arg，Lys；側(cè)鏈基團(tuán)在中性溶液中解離后帶正電荷的氨基酸。

3、3.中性氨基酸 側(cè)鏈基團(tuán)在中性溶液中不發(fā)生解離，因而不帶電荷的氨基酸。可分為： 4、極性氨基酸： Ser，Tyr，Thr，Asn， Gln，Cys，Gly； 5、非極性氨基酸： Phe， Pro， Trp， Ala， Val， Leu，Ile，Met。 6、人體必需氨基酸有八種： Thr Ile Trp Leu Phe Met Val Lys 蘇 異 色 亮 苯 蛋 纈 賴 7、幾種重要的不常見(jiàn)的氨基酸 在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見(jiàn)的氨基酸，通常稱為不常見(jiàn)蛋白質(zhì)氨基酸。這些氨基酸都是由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來(lái)的。其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸

4、等。氨基酸的縮寫(xiě)符號(hào)名稱三字符號(hào)單字符號(hào)丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE組氨酸HisH異亮氨酸IleI甘氨酸GlyG天冬酰胺AsnN名稱三字符號(hào)單字符號(hào)亮氨酸LeuL賴氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV4) 氨基酸的重要理化性質(zhì)：兩性解離、茚三酮顯色、與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)、與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)1、 氨基酸的光吸收 組成天然蛋白質(zhì)分子的20種氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對(duì)近紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm

5、左右，以色氨酸吸收最強(qiáng)?？衫么诵再|(zhì)采用紫外分分光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。2、 氨基酸的解離性質(zhì)與等電點(diǎn) 氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。 在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。 PH 1 7 10 凈電荷 +1 0 -1 正離子 兩性離子 負(fù)離子 等電點(diǎn)PI側(cè)鏈不含離解基團(tuán)的中性氨基酸， pI = (pK1 + pK2 )/2 對(duì)于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK值的算術(shù)平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 +

6、 pKR-COO- )/2 堿性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 三、茚三酮反應(yīng)：氨基酸與茚三酮加熱反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)，其最大吸收峰在570nm波長(zhǎng)處，因此可利用該性質(zhì)進(jìn)行比色可測(cè)定氨基酸的含量。脯、羥氨酸與之反應(yīng)呈黃色，天冬酰胺與之反應(yīng)呈棕色。5) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽、肽鍵、活性多肽及一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)、數(shù)量和排列順序。一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含的共價(jià)鍵指肽鍵（peptide bond）和二硫鍵（disulfide bond）。 一、肽鍵與肽鏈一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵。氨基酸通過(guò)肽鍵相連的化合物稱為肽。

7、 二、多肽 在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。 通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的a-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的a-羧基，稱為羧基端或C-端。 氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開(kāi)始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。 蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。 蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，凡氨基酸殘基數(shù)目在50個(gè)以上，且具有特定空間結(jié)構(gòu)的肽稱蛋白質(zhì)；凡氨基酸殘基數(shù)目在50個(gè)以下，且無(wú)特定空間結(jié)構(gòu)者稱多肽。 三、谷胱甘肽（GSH） 谷胱甘肽是由谷氨酸-Glu、半胱氨酸Cys、甘氨酸Gly組成的，是

8、體內(nèi)重要的還原劑。2分子GSH（還原型谷胱甘肽）脫2H生成一分子GSSC（氧化型谷胱甘肽）。 四、催產(chǎn)素和升壓素 均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。升壓素促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。（作了解） 五、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定原理1 測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求 A.樣品必需純（97%以上）； B.知道蛋白質(zhì)的分子量； C.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成； D.測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。 E.測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。2 N末端氨基酸的分析：二硝基氟苯（DNFBA）法、Edman降解法、氨肽酶法3

9、 C末端氨基酸的分析：肼解法、羧肽酶法6) 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（ -螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、自由回轉(zhuǎn)）、三級(jí)與四級(jí)結(jié)構(gòu)（超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、亞基）及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（1） 維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵 維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵 維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵（二）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure)是指多肽鏈的主鏈骨架中若干肽單位，各自沿一定的軸盤(pán)旋或折疊，并以氫鍵為主要次級(jí)鍵而形成有規(guī)則的構(gòu)象。主要有a-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角。蛋白質(zhì)

10、的二級(jí)結(jié)構(gòu)一般不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。1.肽單位：肽鍵與相鄰的兩個(gè)a碳原子所組成的基團(tuán)，稱為肽單位或肽平面(peptide unit)。 O （1）肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。 CC NC （2）肽單位是剛性平面結(jié)構(gòu)。 H （3）肽單位中與CN相連的H和O原子與碳原子呈反向分布。 （4）多肽鏈的盤(pán)旋或折疊是由肽鏈中許多碳原子的旋轉(zhuǎn)所決定的。2. -螺旋（-helix）：蛋白質(zhì)分子中多個(gè)肽鍵平面通過(guò)氨基酸-碳原子的旋轉(zhuǎn)，使多肽鏈的主骨架沿中心軸盤(pán)曲成穩(wěn)定的-螺旋構(gòu)象。a-螺旋有以下特征：（1）螺旋的方向?yàn)橛沂致菪?，?.6個(gè)氨基酸旋轉(zhuǎn)一周，螺距為0.54 nm，每個(gè)氨基酸殘基的的高

11、度為0.15 nm，肽鍵平面與螺旋長(zhǎng)軸平行。（2）氫鍵是 -螺旋穩(wěn)定的主要次級(jí)鍵。相鄰的螺旋之間形成鏈內(nèi)氫鍵，即一個(gè)肽單位的N上氫原子與第四的肽單位羧基上的氧原子生成氫鍵。（3）肽鏈中氨基酸殘基的R基側(cè)鏈分布在螺旋的外測(cè)，其形狀、大小和電荷等均影響 -螺旋的形成和穩(wěn)定性。3.b-折疊(b-pleated sheet) b-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊的構(gòu)象。-折疊有以下特征：a. 肽鏈的伸展使肽鍵平面之間一般折疊成鋸齒狀；b. 肽鏈平行排列，相鄰肽鏈之間的肽鍵相互交替形成氫鍵，是維持這種結(jié)構(gòu)的主要次級(jí)鍵；c. 肽鏈平行的走向有

12、順式和反式兩種；d. 肽鏈的氨基酸殘基的R鍵分布在片層的上下。4. b-轉(zhuǎn)角(b-bend)-轉(zhuǎn)角是多肽鏈180回折部分所形成的一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)特征為： 主鏈骨架本身以大約180回折; 回折部分通常由四個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成; 構(gòu)象依靠第一殘基的-CO基與第四殘基的-NH基之間形成氫鍵來(lái)維系。 (4)這類(lèi)結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。5. 無(wú)規(guī)線圈(random coil) 無(wú)規(guī)線圈是指多肽鏈主鏈部分形成的無(wú)規(guī)律的卷曲構(gòu)象。 沒(méi)有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)，但仍是緊密有序的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，通過(guò)主鏈間及主鏈與側(cè)鏈間氫鍵維持其構(gòu)象(3) 超二級(jí)結(jié)構(gòu)（基序） 是指在多肽內(nèi)順序上相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近

13、,彼此相互作用,形成有規(guī)則的的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體。超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本形式：； ；。超二級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域。（4） 結(jié)構(gòu)域(domain) 結(jié)構(gòu)域：是位于超二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)間的一個(gè)層次。在較大的蛋白質(zhì)分子中,由于多肽鏈上相鄰的超二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系,進(jìn)一步折疊形成一個(gè)或多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的致密的三維實(shí)體,即結(jié)構(gòu)域。有的蛋白質(zhì)分子有一個(gè)結(jié)構(gòu)域,有的有多個(gè)。(5） 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiary structure)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域的一條多肽鏈, 由于其序列上相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用, 而進(jìn)行范圍更廣泛的盤(pán)曲和折疊, 形成包括主、側(cè)鏈在內(nèi)的空

14、間排列, 這種在一條多肽鏈中所有原子或基團(tuán)在三維空間的整體排布稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中所有原子或基團(tuán)的空間排列。即多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，由氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用使多肽鏈進(jìn)一步盤(pán)旋和折疊，導(dǎo)致整個(gè)分子形成不規(guī)則的特定構(gòu)象。（6） 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)(Quaternary Structure) 由兩個(gè)或兩個(gè)以上的亞基之間相互作用，彼此以非共價(jià)鍵相聯(lián)而形成更復(fù)雜的構(gòu)象，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。 亞基(subunit)就是指參與構(gòu)成蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的、每條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈。7) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)：大分子性質(zhì)、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定（離心法、凝膠過(guò)濾法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、兩性

15、解離（等電點(diǎn)、電泳、離子交換）、膠體性質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白質(zhì)變性、紫外吸收及顏色反應(yīng)1、 蛋白質(zhì)分子的大小、形狀及分子量的測(cè)定1.分子篩層析法 2.SDS-PAGE 3.生物質(zhì)譜 4.超速離心法二、蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的高分子特性形成了復(fù)雜而特定的空間構(gòu)象，從而表現(xiàn)出蛋白質(zhì)特異的生物學(xué)功能。某些物理的和化學(xué)的因素使蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，導(dǎo)致其生物活性的喪失和一些理化性質(zhì)的改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation) 。1. 變性的本質(zhì) 蛋白質(zhì)變性作用的本質(zhì)是破壞了形成與穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的次級(jí)鍵，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的改變或破壞，而不

16、涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變或肽鍵的斷裂。2. 變性作用的特征（1）生物活性的喪失（2）某些理化性質(zhì)的改變物理性質(zhì)改變，如：溶解度降低，粘度升高，失去結(jié)晶能力，旋光值改變?；瘜W(xué)性質(zhì)改變，如：蛋白質(zhì)變性時(shí)，有些原來(lái)在分子內(nèi)部包藏而不易與化學(xué)試劑起反應(yīng)的側(cè)鏈活性基團(tuán)，由于結(jié)構(gòu)的伸展松散而暴露，易與化學(xué)試劑反應(yīng)。（如-SH、咪唑基、-OH）。生物化學(xué)性質(zhì)改變：蛋白質(zhì)變性后，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易為蛋白質(zhì)水解酶所分解。生物堿試劑變性：三氯醋酸、磷鎢酸、水楊酸等。在pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電，和有 機(jī)酸根離子易結(jié)合形成沉淀，導(dǎo)致變性。重金屬鹽變性：在pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，更易與重金屬離子（Hg2、Pb2+、Cu2

17、+）結(jié)合形成沉淀，導(dǎo)致變性。 兩性電離 三、蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn) 兼性離子 PH=PI陽(yáng)離子PHPI在等電點(diǎn)時(shí)(Isoelectric point，pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis)。4、 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1. 蛋白質(zhì)表面具有水化層2. 蛋白質(zhì)表面具有同性電荷5、 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)鹽析法 高鹽濃度時(shí)，因破壞蛋白質(zhì)水化層并中和其電荷，促使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，

18、這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。 低度濃度可使蛋白質(zhì)溶解度增加，稱為鹽溶作用有機(jī)溶劑沉淀 與水互溶的有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇等），這些溶劑與水的親和力大，能奪取蛋白質(zhì)顆粒上的水化膜，加之有機(jī)溶劑的介電常數(shù)低，分子間引力加大，蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。加熱沉淀反應(yīng) 加熱滅菌的原理是因加熱使細(xì)菌蛋白變性凝固而失去生物活性的結(jié)果。 重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1. 茚三酮反應(yīng)：在pH57時(shí)，蛋白質(zhì)與茚三酮丙酮液加熱可產(chǎn)生藍(lán)紫色。2. 雙縮脲反應(yīng)：蛋白質(zhì)在堿性溶液中可與Cu2+產(chǎn)生紅色反應(yīng)。3.酚試劑反應(yīng)：在堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸可與酚試劑生成藍(lán)色化合物8) 蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理一. 蛋白質(zhì)的提取二. 蛋白質(zhì)的分離與純化1. 根據(jù)溶解度不同的分離純化方法：（1）等電點(diǎn)沉淀法（2）鹽析沉淀法（3）低溫有機(jī)溶劑沉淀法（4）溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響2. 根據(jù)分子大小不同的分離純化方法：（1）透析和超濾法（2）分子篩層析 原理：利用分子量的差異（3） 密度梯度離心3. 根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法（1）電泳法（2）離子交換層析 陰離子交換樹(shù)脂含有堿性基團(tuán)