微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法演示課件

1、1,微生物分子生態(tài)學(xué)的一些研究方法,2,微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是微生物生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。,群落結(jié)構(gòu)決定了生態(tài)功能的特性和強(qiáng)弱。 群落結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素。 群落結(jié)構(gòu)變化是標(biāo)記環(huán)境變化的重要方面。,通過對(duì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解析并研究其動(dòng)態(tài)變化，可以為調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供可靠的依據(jù)。,3,20世紀(jì)70年代以前：傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，依靠形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征、生理生化特性的比較進(jìn)行分類鑒定和計(jì)數(shù)，認(rèn)識(shí)是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。,微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法：,在70和80年代：對(duì)微生物化學(xué)成分的分析，建立了一些微生物分類和定量的方法

2、（生物標(biāo)記物方法），對(duì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的認(rèn)識(shí)進(jìn)入到較客觀的層次上。,在80和90年代：現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以DNA為目標(biāo)物，通過rRNA基因測(cè)序技術(shù)和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，并給出了關(guān)于群落結(jié)構(gòu)的直觀信息。,4,雖然可以檢測(cè)環(huán)境中的活細(xì)胞，并且對(duì)微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展起了很重要的作用。 采用配比簡(jiǎn)單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少 （不到1 % ）。 Amann 等人報(bào)道在自然環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的微生物占總的微生物數(shù)量的比例范圍從0.001%（海水）到0.3%（土壤）。

3、不能全面地反映微生物區(qū)系組成狀況，煩瑣、耗時(shí)。,1、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法,5,2、群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP),微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關(guān)的。 如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標(biāo)記分子之一。 由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)，通過檢測(cè)微生物樣品對(duì)底物利用模式來反映種群組成的酶活性的分析方法。 具體而言，CLPP就是通過檢測(cè)微生物樣品對(duì)多種不同的單一碳源的利用能力，來確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生對(duì)基質(zhì)利用的生理代謝指紋。,6,BIOLOG鑒定系統(tǒng),自動(dòng)化、快速,可鑒定細(xì)菌有

4、1140多種、酵母菌267種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。,每個(gè)孔中含有不同的底物,菌懸液或無菌水,僅能鑒定快速生長(zhǎng)的微生物，誤差較大（pH），擁有的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫還不完善,在96孔細(xì)菌培養(yǎng)板上檢測(cè)微生物對(duì)不同發(fā)酵性碳源（95種）利用情況。 干膜上都含有培養(yǎng)基和氧化還原染料四唑 微生物利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí)（產(chǎn)生的NADH），會(huì)將四唑從無色還原成紫色。,7,3、生物標(biāo)記物法（Biomakers ）,生物標(biāo)記物通常是微生物細(xì)胞的生化組成成分，其總量通常與相應(yīng)生物量呈正相關(guān)。 特定的標(biāo)記物標(biāo)志著特定的微生物，一些生物標(biāo)記物的組成模式(種類、數(shù)量和相對(duì)比例)可作為指紋估價(jià)微生物群落結(jié)構(gòu)。 首先使用一種合適的提取

5、劑直接把生物標(biāo)記物從環(huán)境中提取出來，然后對(duì)提取物進(jìn)行純化，后用合適的儀器加以定量測(cè)定。,優(yōu)點(diǎn)：不需要把微生物的細(xì)胞從環(huán)境樣中分離，能克服由于培養(yǎng)而導(dǎo)致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。,8,醌指紋法(Quinones Profiling),呼吸醌廣泛存在于微生物細(xì)胞膜中，在電子傳遞鏈中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone輔酶Q) 和甲基萘醌(menaquinone維生素K)。醌可以依據(jù)側(cè)鏈含異戊二烯單元的數(shù)目和側(cè)鏈上使雙鍵飽和的氫原子數(shù)進(jìn)一步區(qū)分。,每一種微生物都含有一種占優(yōu)勢(shì)的醌，而且不同的微生物含有不同種類和分子結(jié)構(gòu)的醌。因此，醌的多樣性可定量表征微生物的多樣性，醌譜圖（即醌指紋

6、）的變化可表征群落結(jié)構(gòu)的變化。,醌指紋法具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)。,9,磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，約占細(xì)胞干重的5%。在細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細(xì)胞中存在，十分適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。,磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）譜圖分析,脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。,甲基脂肪酸酯是細(xì)胞膜磷脂水解產(chǎn)物，氣相色譜分析系統(tǒng)分析出全細(xì)胞的FAME譜圖。,脂肪酸譜圖法分類水平較低，不能鑒定到種。另外，不同微生物種屬

7、之間脂肪酸組成有重疊，外來生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對(duì)種群結(jié)構(gòu)解析的可靠性。,磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。,10,4. ERIC (腸桿菌基因間保守重復(fù)序列) -PCR指紋圖譜技術(shù),11,12,13,Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6種純菌組成的混合菌的組成，獲得了高重復(fù)性的指紋圖譜，比常規(guī)RAPD-PCR相比更能反映菌群的組成特征。,在微生物群落中，各細(xì)菌數(shù)量占1-10%時(shí)，其特征性ERIC-PCR主條帶就可以在指紋圖中表現(xiàn)出來。ERIC-PCR指紋圖中，每一條帶可以是來自若干種不同微生物的基因組DNA片段，條帶的

8、數(shù)目反映微生物類群的多少，條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低。,分析不同環(huán)境樣品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指紋圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個(gè)群落在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化。,14,E1: 5-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3 E2: 5-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3,ERIC-PCR引物20 pmol/l,15,16,5. 以PCR為基礎(chǔ)的rRNA及rDNA的分析方法,用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重復(fù)序列和隨機(jī)基因組序列等。 最常用的標(biāo)記序

9、列是核糖體操縱子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個(gè)重要指標(biāo)。,17,Diversity estimation based on molecular markers,18,實(shí)驗(yàn)原理,16S rDNA是基因組的“biomarker” 核糖體RNA是蛋白質(zhì)合成必需的，16S rDNA廣泛存在于所有原核生物的基因組中。 16S rDNA的序列中包括保守區(qū)和可變區(qū)。 序列變化比較緩慢，與物種的形成速度相適應(yīng)，而且一般不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。 GeneBank和RDP（Ribosomal DatabaseProject ）數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄了

10、超過97,128個(gè)經(jīng)過比對(duì)和注釋的16S rDNA序列，可供進(jìn)行比對(duì)。,19,16S ribosomal RNA,Present in all life molecular chronometer taxonomy (large database) evolution one active bacterial cell: 104 copies 15 rRNA genes (i.e., rDNA) (Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfolobus solfataricus with 1 copy, Clostridium

11、 paradoxum with 15 copies) 1500 nt (enough information) four different domains conserved regions (no variation among all life) variable regions (V1-V9),Source: Louis, B., Gene IV, 1997,20,環(huán)境16S rDNA文庫的構(gòu)建與組成分析技術(shù),21,1990年，Giovannoni等首先用這一方法分析馬尾藻海海面上浮游微生物的多樣性。 16S rDNA文庫中的藍(lán)藻種類與培養(yǎng)出來的藍(lán)藻很不一致； 發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的且在該環(huán)境

12、中占優(yōu)勢(shì)的微生物類群； 與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法相比，更全面得揭示了微生物多樣性； 這一方法目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于土壤、海洋、湖泊、腸道等多種生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的調(diào)查，揭示了環(huán)境當(dāng)中前所未知的微生物的多樣性。,22,構(gòu)建環(huán)境16S rDNA文庫的方法,用環(huán)境基因組總DNA進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增：把環(huán)境中幾乎所有微生物基因組上的16S rDNA擴(kuò)增并收集到一起。 universal primers: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5-TACCTTGTTACGACTT-3 (E.coli bases 1

13、507 to 1492) “TA克隆”：把每一個(gè)16S rDNA分子放到文庫中的每一個(gè)克隆里。,23,24,25,陽性克隆篩選的過程： 1.Amp抗性，挑選出含有質(zhì)粒的克隆 2.藍(lán)白斑篩選，挑出帶有插入片段的克隆 3.PCR篩選，挑出帶有正確長(zhǎng)度插入片段的克隆,26,ARDRA分型與測(cè)序,各OTU含有的克隆數(shù)量,27,克隆文庫的統(tǒng)計(jì)分析,28,Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP),16S rDNA,Liu et al., 1997, AEM,29,變性梯度凝膠電泳（DGGE）,變性梯度凝膠電泳（Denatured

14、gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世紀(jì)80 年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測(cè)DNA 片段中的點(diǎn)突變。 Muyzer 等人在1993 年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究 。后來又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。 此后十年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一 。,30,原理,雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的

15、DNA 片段能夠被區(qū)分開，但同樣長(zhǎng)度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，不能被區(qū)分。,DGGE/TGGE 技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開來。,一個(gè)特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。,一個(gè)幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA 片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。,31,顯示的是一個(gè)234bp 長(zhǎng)的DNA 片段的解鏈區(qū)域，橫坐標(biāo)是該DN

16、A 片段的序列，依次從第一個(gè)堿基到第234 個(gè)堿基；縱坐標(biāo)是解鏈溫度。該DNA 片段共有3 個(gè)解鏈區(qū)域。 MD1 是解鏈溫度最低的一個(gè)解鏈區(qū)域，MD3 是溫度最高的一個(gè)解鏈區(qū)域。,32,不同的雙鏈DNA 片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。,當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時(shí)，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時(shí)DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。,一旦DNA 片段遷移到一定位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會(huì)急劇降低。因此，不同的DNA 片段會(huì)在膠中的不同

17、位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。,33,然而，當(dāng)變性劑濃度達(dá)到DNA 片段最高的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，DNA 片段會(huì)完全解鏈，此時(shí)它們又能在膠中繼續(xù)遷移，這些片段就不能被區(qū)分開來。,在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個(gè)堿基對(duì)）可以解決這個(gè)問題。,含有GC 夾子的DNA 片段解鏈溫度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。,當(dāng)加了GC 夾子后，DNA 片段中每個(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。,34,35,當(dāng)用DGGE/TGGE 技術(shù)來研究微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，要結(jié)合PCR（polymerase chain react

18、ion）擴(kuò)增技術(shù)，用PCR 擴(kuò)增的16S rDNA 產(chǎn)物來反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成。,通常根據(jù)16S rRNA 基因中比較保守的堿基序列設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5-端含有一段GC 夾子，用來擴(kuò)增微生物群落基因組總DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE 分析。,由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片斷，所以一般選擇擴(kuò)增16S rRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。,36,37,38,熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization ）,39,利用熒光標(biāo)記的寡聚核苷酸探針標(biāo)記16S rRNA或23S rRNA，然后進(jìn)行原位雜交探測(cè)，可以在原

19、位狀態(tài)下探測(cè)特定生物細(xì)胞，并可提供部分關(guān)于形態(tài)、空間分布等方面的信息。,通過FISH技術(shù)可以解決在固定群落中微生物的分布問題。原始的生物膜和絮狀污泥用多聚甲醛固定在凝膠包被的玻璃上，固定并已穿孔的細(xì)胞與熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，DNA探針就會(huì)與細(xì)胞中互補(bǔ)的DNA或RNA雜交；然后在熒光顯微鏡下就可以觀察到發(fā)光的細(xì)胞，偶聯(lián)的FISH在激光共聚焦顯微鏡下可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞在微生物菌落三維結(jié)構(gòu)中的定位。,40,常用熒光原位雜交探針一覽表,41,FISH常用熒光素,42,10 m,Desulfotomaculum (DFMI227a ) 48.06 3.04% Methanosaeta (MX825)

20、 49.17 2.63%,20 m,Bacteria (EUB338 I/II/III) 48.06 3.04% Archaea (ARC915) 49.17 2.63%,Fluorescence in situ hybridization (FISH),43,Microbial community determined by Fluorescent In-Situ Hybridization (FISH), universal gamma probe, universal specific probe 1 specific probe 2,44,基于16S rRNA基因的分類微陣列 高通量的

21、分析微生物群落結(jié)構(gòu)，成為檢測(cè)復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的重要工具。 lab-on-a-chip ：這種 lab-on-a-chip被設(shè)計(jì)成可以分離各種微生物細(xì)胞、裂解后純化DNA 或 mRNA，這個(gè)研究領(lǐng)域?qū)τ诟罾斫馕⑸锏娜郝浣Y(jié)構(gòu)具有重要影響。,分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的方法的最近進(jìn)展：,45,未培養(yǎng)微生物資源的開發(fā)：,任何微生物培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基都不能完全再現(xiàn)全部微生物的自然生存環(huán)境，使用免培養(yǎng)技術(shù)和基因組技術(shù)，直接分離土壤系統(tǒng)中未培養(yǎng)微生物DNA樣品并建立相應(yīng)的生態(tài)基因組庫，通過高通量篩選技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的新的重要功能基因的研究，鑒定參與污染物降解與轉(zhuǎn)化、各種抗酸、抗鹽、抗?jié)瘛⒖购导翱梗停?/p>

22、重金屬毒害等抗逆特殊功能基因。 我國科學(xué)加已經(jīng)建立了深海樣品、云南騰沖熱泉，青海藏牦牛瘤胃、造紙廠廢水排污口和傳統(tǒng)堆肥未培養(yǎng)微生物的生態(tài)基因文庫，獲得了一批具有特殊性質(zhì)和應(yīng)用前景的淀粉酶、蛋白酶和脂酶編碼基因。,46,生 物 圈,種類豐富多樣的微生物,分離培養(yǎng),大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),宏基因組篩選,獲得產(chǎn)物,通過構(gòu)建宏基因組表達(dá)文庫，通過基于序列或酶活力篩選文庫獲得目的基因。 缺陷：超高通量的篩選或者需具有選擇標(biāo)記的分析方法。 進(jìn)展：底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選。構(gòu)建 GFP表達(dá)載體，通過 fluorescence-activated cell sorting (FACS)來篩庫. 宏基因組DNA克隆到gfp

23、上游，首先排除組成表達(dá)的克隆. 不發(fā)熒光的克隆在底物上生長(zhǎng)，來篩選誘導(dǎo)表達(dá)gfp的克隆，這種篩選方法利用代謝基因被底物誘導(dǎo)表達(dá)的特性。,Screening metagenomic expression libraries,47,針對(duì)未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)技術(shù)研究,微生物不可培養(yǎng)的原因 培養(yǎng)條件 營養(yǎng)限制 失去生態(tài)位,48,模擬原位生態(tài)條件的培養(yǎng)技術(shù),主體為一個(gè)墊圈，兩側(cè)用0.22um的濾膜封住，允許環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)通過，但不允許細(xì)胞通過。在魚缸底部倒上一層海底沉積物，其上放置擴(kuò)散室，加入天然海水至剛好漫過擴(kuò)散室，使海水不斷循環(huán)。 Isolating “Uncultivable” Microorga

24、nisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment,T. Kaeberlein, K. Lewis,* S. S. Epstein*, SCIENCE VOL 296 10 MAY 2002,Accessing the uncultivated microbial majority through cultivation-based approaches,49,Science 2002,50,土壤宏基因組（Metagenome）計(jì)劃,把所有緊密聯(lián)系在一起的土壤-生物的團(tuán)聚體理解為是一個(gè)“土壤細(xì)胞”，把這一特定的土壤功能單位內(nèi)全部生物遺傳物質(zhì)總和看成是一個(gè)基因組，即土壤宏基因組, 通過宏基因組測(cè)序策略（metagenomics sequencing strategy）隨機(jī)鳥槍法測(cè)序（rando