第八單元染色與染料

1、 第八單元 染色與染料 第一節(jié) 染色的概念和目的 用染液對組織(切片)進行處理，使組織中的不同成分被染上相應(yīng)的顏色或深淺不一，產(chǎn)生不同的折射率，以利于(光學)顯微鏡觀察和分析的過程稱為染色 利用染料在組織切片上給與顏色，使其與組織或細胞內(nèi)的某種成分發(fā)生作用，經(jīng)過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細結(jié)構(gòu)能顯現(xiàn)不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細胞的各種成分 未加染色的切片在顯微鏡下除了能夠辨認細胞和細胞核的輪廓以外，看不清楚其他任何結(jié)構(gòu) 即使由于組織內(nèi)部各種物質(zhì)的折射指數(shù)不同，從光線的明暗上能使我們看到一些組織結(jié)構(gòu)，但也是極其簡單而有限的。遠遠不能滿足觀察和診斷的要求 我們不僅要通過顯微鏡

2、視野來看到組織和細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還要通過組織和細胞的形態(tài)變化來研究它的發(fā)生和發(fā)展.因此染色的技術(shù)才逐漸發(fā)展成為制片過程中的一個重要環(huán)節(jié) 它較固定、脫水、包埋、切片等步驟遠為復雜，理論性強，技術(shù)要求嚴格，已經(jīng)成為一門獨立的科學，它在組織學，病理學等學科中已占有相當?shù)牡匚?第二節(jié) 染色的分類一、一般分類法 通常有常規(guī)染色、特殊染色、細胞染色、組織化學染色、免疫組織化學染色和熒光染色等 常規(guī)染色通常指病理學常規(guī)制片最廣泛應(yīng)用的蘇木精-伊紅染色法（H-E染色法），又稱普通染色法 組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特點與病變，用常規(guī)染色法基本上都可以顯示出來，故大多數(shù)組織病變用常規(guī)染色即可做出診斷或初步診斷 在常規(guī)染

3、色的基礎(chǔ)上，為了專門顯示特殊組織或其物質(zhì)成分，證明或區(qū)分各種組織細胞、病變和物質(zhì)的特點，可進行相應(yīng)的特殊染色或其他染色二、按組織或成分分類 包括結(jié)締組織染色、肌肉組織染色、神經(jīng)組織染色、脂類染色、糖原染色、粘液染色、色素染色、病理性沉著物染色、病原微生物染色、內(nèi)分泌細胞染色、脫落細胞染色、核酸染色、酶染色和免疫組織化學染色等三、按染色方法分類 有切片染色法、蠟帶染色法、組織塊染色法、大體標本染色法、整體染色法和涂片染色法等 四、按染色的步驟分類 單一染色法:用一種染液只染某種單一成分的染色 （如用鐵蘇木精染睪丸生殖細胞） 復染色法:用兩種不同性質(zhì)的染然料進行染色 （如H-E染色） 多色染色法:

4、用三種或三種以上不同顏色的染色 （如Mallory氏結(jié)締組織多色染色法）五、按染料的濃、淡程度和用不用 媒染物分類 有漸進法與后退法、直接法與間接法 此外還有金屬沉淀法、活體染色法 有按發(fā)明者的姓名命名、組織化學染色稱為反應(yīng)法 第三節(jié) 染色的原理一、基本原理 染色就是利用染料在組織切片上給與顏色，使其與組織或細胞內(nèi)的某種成分發(fā)生作用，經(jīng)過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細結(jié)構(gòu)能顯現(xiàn)不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細胞的各種成分 大多數(shù)染色的原理至今仍未搞清楚，通常染色劑與組織細胞相結(jié)合而使組織細胞著色的過程與化學反應(yīng)和物理現(xiàn)象兩者都有關(guān)系 二、化學反應(yīng) 染料或組織都具有酸堿化學性質(zhì)

5、任何染料均可電離，離解出陽離子或陰離子 酸性染料中的酸性部分有染色作用的是陰離子；堿性染料中的堿性部分有染色作用的是陽離子，細胞內(nèi)同時含有酸性和堿性物質(zhì)，酸性物質(zhì)與堿性染料中的陽離子相結(jié)合 如細胞核（含有核酸）、黏液和軟骨基質(zhì)呈酸性部分被堿性染料蘇木精所染；反之堿性物質(zhì)與酸性染料的陰離子相結(jié)合，如細胞質(zhì)及其內(nèi)部的某些顆粒物質(zhì)被酸性染料伊紅所染 三、物理現(xiàn)象（一）吸附作用 吸附作用是固體物質(zhì)的特性，染液中分散的色素粒子受分子引力作用，吸附于被染物質(zhì)的粒子間隙內(nèi)而染色，如活性炭吸附毒氣或色素（二）吸收作用 染液中分散的色素粒子被組織吸收，并溶解于組織中而被染色，又稱溶解作用，如用蘇丹染料浸染脂肪，

6、此種染色一般較牢固 吸附和吸收統(tǒng)稱為吸著 此外還可有沉淀作用和毛細現(xiàn)象或滲透作用等 第四節(jié) 染 料 染料就是染色所用的試劑，又稱染色劑 這里所說的染料是指生物學用的染色劑，即專供染顯微鏡標本用的染料，較一般工業(yè)用的染料有效成分含量高、雜質(zhì)少 生物學所用的染料必須是生物學染色劑,有的是藥用染料，有的是抑菌劑，還有一些是指示劑和化學試劑，一般通稱為染料 一、染料的性質(zhì) （一）染料的一般性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點 染料不僅要有顏色，而且對被染物和組織成分還必須有親和力 染料中應(yīng)含有發(fā)色團和助色團 1發(fā)色團 是使染料顯色的化學團，即色原 通常是能使有機分子產(chǎn)生顏色的含有不飽和鍵的基團；一般一種染料含一個或幾個發(fā)色

7、團 主要的發(fā)色團有：偶氮基、亞硝基、硝基、羰基、乙烯基等 染料顏色的深淺取決于發(fā)色團的多少、強弱 發(fā)色團愈多其顏色愈深，強發(fā)色團（如偶氮基、亞硝基）一種染料中有一個即可呈色 而其他弱發(fā)色團需有數(shù)個才能顯色 發(fā)色團分為堿性及酸性兩種 堿性發(fā)色團有偶氨基、嗪基、印胺基等；酸性發(fā)色團有硝基、亞硝基及醌型苯環(huán)等2 助色團 是指使色原產(chǎn)生電離成為鹽類對組織或其被染物產(chǎn)生親和力的原子團 通常是與發(fā)色團（不飽和鍵）及飽和烴相連的帶有雜原子的飽和基團 如氨基、二甲氨基、羥基、磺酸基等 助色團能使染料分子顏色加深、極性加大，并與被染分子間形成親和力 只有發(fā)色團而無助色團時，因其對組織無親和力故不能稱為染料 染料

8、對組織的染色能力是發(fā)色團和助色團的共同作用 （二）染料的酸堿性 注意：不能與染液的酸堿性發(fā)生混淆（染料本身的酸堿性質(zhì)既不是用來表明反應(yīng)，也不意味著是屬子酸類或堿類，一般都是鹽類） 一般是跟據(jù)助色團的性質(zhì)來判定染料的酸堿性： 所謂酸性染料是指含有酸性助色團的、能與堿作用生成鹽的、其水溶液電離后為陰離子的染料 所謂堿性染料是指含有堿性助色團的、能與酸作用生成鹽的、其水溶液電離后為陽離子的染料 最恰當?shù)姆椒ㄊ前阉嵝匀玖虾蛪A性染料分別改稱為陰離子染料和陽離子染料二、染料的分類（一）按來源1.天然染料 是從動物、植物中提煉出來的染料 主要是蘇木精、胭脂紅、地衣紅、番紅花等2.合成染料 多數(shù)是從煤焦油中提

9、取的苯衍生物，品種繁多 還有一些無機化合物，如硝酸銀、氯化金、磺、鋨酸、高錳酸鉀等 （二） 按發(fā)色團的結(jié)構(gòu)類型1.亞硝基染料：發(fā)色團為亞硝基（如萘酚綠-B）2.硝基染料：發(fā)色團為硝基（如苦味酸）3.偶氮染料：在苯環(huán)或苯環(huán)之間有一個或數(shù)個偶氮基 發(fā)色團（如桔黃G，蘇丹、，蘇丹 黑，油紅“0”）4.醌亞胺類染料（如甲苯胺藍，亞甲藍，焦油紫， 天青石藍）5.苯甲烷類染料（如酸性復紅，堿性復紅，甲基 紫，亮綠）6.吖叮類染料（如伊紅Y、B，吖啶紅，吖啶橙）（三）根據(jù)染料的主要用途1.細胞核染料 蘇木素、核固紅、結(jié)晶紫、甲苯胺藍等2.細胞質(zhì)染料 伊紅Y、酸性復紅、桔黃G、光綠、苦昧酸等3.脂肪染料 油紅

10、“0”、蘇丹、蘇丹等4.纖維結(jié)締組織染料 苦味酸、麗春紅、亮綠等 （四）按染料的化學反應(yīng)1.堿性染料 含有堿性助色團 一般作為細胞核染色劑，主要有：蘇木素、甲笨胺藍、亞甲藍、堿性復紅、甲基紫、中性紅、甲基綠等2.酸性染料 含有酸性助色團 一般為細胞質(zhì)染色劑，主要有：伊紅、酸性復紅、苦味酸、光綠、桔黃G等3.中性染料(復合染料) 由堿性和酸性染料配制而成 如血液涂片常用的 Wright染液和Giemsa染液等三、常用主要染料的性質(zhì)及用途 （一）蘇木精（素） 蘇木精是最早用于生物學上的天然染料之一 ，是從蘇木樹的樹心中提煉出來的 易溶于乙醇、甘油，也可溶于熱水，屬堿性染料 其本身沒有染色能力，須氧

11、化（經(jīng)自然或人工）成熟并加入含金屬離子的媒染劑（如鉀、氨明礬），才能達到染色的目的 ， 由于配制染液初期和溶液的表面為紫藍色，也稱蘇木紫 因氧化成熟的溶液為紅色，還稱為蘇木紅 在生產(chǎn)制作時加入氧化劑已經(jīng)熟化的又稱蘇木因（二）伊紅 又稱曙紅、黃光伊紅、黃光曙紅 ，為紅色粉末，是一種化學合成的酸性染料 伊紅是常規(guī)蘇木精染色的對比染色 最常用的染料 又分水溶性與醇溶性兩種，病理組織學常規(guī)染色多用水溶性的 水溶性伊紅從字面上易使人誤認它只溶于水而不溶于乙醇，其實只是溶解度大小不同而已 其他常用染料（略） 第 五 節(jié)媒染劑 促染劑 分化劑 封固劑 染色除要用染料外，還需以下試劑：一、媒染劑 凡是有促進染

12、色能力，對染料和組織都有親和力并與染料和組織結(jié)合在一起的試劑稱之為媒染劑 常見的媒染劑有：硫酸鋁鉀、磷鉬酸、鉻鹽、磷鎢酸等二、促染劑 凡是能促使染料對組織著色，增強染色能力，但本身不參與染色反應(yīng)的試劑稱為促染劑 如（冰）醋酸（乙酸）等 三、分化劑 凡能有選擇性地除掉組織切片上一定顏色的試劑或溶液，稱為分化劑 分化堿性染料可用稀的酸性溶液，而分化酸性染料則用稀的堿性溶液 常用的分化劑有（一）氧分化劑：實際上是簡單的漂白。如高鐵氰化鉀（二）酸性分化劑：能與媒染劑（金屬）相結(jié)合形成可溶性鹽類，從而打開了媒染劑和組織細胞的結(jié)合，使組織細胞脫色。如乙酸、鹽酸（三）媒染分化劑 ：將已染色的切片再放到媒染劑

13、的溶液中，則可使已經(jīng)和組織相結(jié)合的染色劑脫去 （四）具有脫水兼分化作用的分化劑 脫水劑本身就是很多染色的分化劑，例如乙醇，特別是95以下的乙醇就是伊紅的分化劑 （五）水及其他溶液的分化作用 在多數(shù)染色方法中，一般在染色后都要蒸餾水或自來水及稀的醋酸水溶液沖洗。這一方面是為了清除殘留在組織上面的染液和使切片清潔，而另一方面也是為輕度的分化 四、封固劑（加蓋劑、裱媒） 封固劑能使染色后的組織切片被封藏在載玻片與蓋玻片之間，使之不與空氣接觸，防止氧化褪色 雖本身雖不參與染色過程，但具有保持色澤的作用；同時組織切片在封固劑的作用下，其折光率能和玻片的折光率相似，從而便于鏡檢 。常用的有：（一）濕性封固

14、劑 此類封固劑使用方便，組織切片不必經(jīng)過脫水、透明等步驟即可封固 如甘油、甘油明膠（二）干性封固劑 用于石蠟，冰凍和火棉膠切片的封固，使用時組織切片必須脫水，透明徹底 如中性樹膠 第 六 節(jié)染色的一般問題及注意事項一、染色前的處理（一）脫蠟水洗 凡是石蠟切片在進行各種染色之前都必須經(jīng)過脫蠟水洗處理 石蠟切片在染色前的脫蠟水洗處理必須徹底，尤其是于二甲苯內(nèi)的脫蠟時間寧長勿短 脫蠟水洗用的各級二甲苯和乙醇應(yīng)經(jīng)常更換新液 （二）除掉組織切片內(nèi)的汞鹽沉淀物 需要時（三）除福爾馬林色素 固定時間久的（四）鉻化處理 需要時二、染色問題及注意事項（）溶媒問題 配制染液的溶媒主要是蒸餾水，其次為乙醇，其他較少

15、應(yīng)用 配制染液選擇溶媒時，要注意染料的性質(zhì)、染色作用及染色結(jié)果等 如配制伊紅染液時，水溶性伊紅應(yīng)用蒸餾水配制，而醇溶性的伊紅則應(yīng)用乙醇配制；如配制蘇木精染液時，為使蘇木精充分溶解，應(yīng)注意到蘇木精易落于乙醇，故先用乙醇使其溶解后再加入其他溶液內(nèi)，有的需用水溶解的可以加溫或充分攪拌方妥 （二）染液的濃度 第 七 節(jié)染色常用術(shù)語概念及說明 一、脫蠟水洗常規(guī) 這是在染色方法中常用的簡略用語 即指石蠟切片在染色前，必須經(jīng)過由二甲苯溶解切片上的石蠟，再由高至低各濃度乙醇置換二甲苯，并逐漸加水，最后再用自來水及蒸餾水沖洗切片的常規(guī)方法之全過程 二、脫水透明封固 這是在染色方法中經(jīng)常應(yīng)用的又一簡略用語 組織切

16、片在染色后，由低（95）至高各濃度乙醇脫水，再用二甲苯置換乙醇，使組織呈現(xiàn)透明狀態(tài)后，用中性樹膠將組織切片封固于載玻片與蓋玻片之間三、退行性染色與進行性染色 退行性染色是用染液將組織過染后，再用分化劑有選擇性地去掉不該著色的部分，使該著色的部分更加清晰適度（如H-E染色中，明礬蘇木精的染色就是退行性染色，染色時使胞核及胞質(zhì)都染上色了，然后再見鹽酸乙醇分化） 進行性染色是由于染料對組織某種特殊結(jié)構(gòu)或物質(zhì)有余合力，具有選擇性著色的特點。染色時當染液將所染的組織成分染成適宜的顏色強度后，就終止染色，而勿需用分化劑進行調(diào)正色調(diào)的染色方法（如脂肪組織的蘇丹染色）四、分化注意：不要與組胚的分化混淆 指組織

17、切片經(jīng)染色（過染）后，用分化劑有選擇地將不該著色的部分顏色除掉，使該著色部分的顏色適宜 分化的不好，可使不該著色的組織成分還保持有顏色及該著色的色調(diào)過深 如是分化過度，該著色的顏色很淺 對于分化恰好適宜的，有的也稱為分化好五、對比染色與復染 將組織細胞的不同結(jié)構(gòu)成分，用兩種或兩種以上顏色分別地顯示出來 其不同色調(diào)可用混合染液同時染色（VG染色同時將膠原纖維與其他結(jié)締組織及肌肉等染成不同顏色的對比染色）或用單一染液分別染色（如H-E染色就是胞核與胞質(zhì)的對比染色，為兩次分別染色） 復染通常應(yīng)用于特殊染色，即先將組織細胞的某一特殊結(jié)構(gòu)或其物質(zhì)成分，用相應(yīng)的染色方法染色之后，再用另一種染色方法或單一染液進行染色，稱后一種染色為復染或陪襯染色。復染的色調(diào)是為了陪襯主要染色之顏色，故與對比染色不同，復