（魯京津瓊）2020版高考生物總復(fù)習(xí)考點(diǎn)加強(qiáng)課6課件.pptx

1、1.限制酶的選擇原則,1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類 應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖甲可選擇Pst。 不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇Sma。 為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst 和EcoR 兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)，而且這種切點(diǎn)不致于完全破壞“標(biāo)記基因”,2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類,所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。 質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不

2、要破壞這些結(jié)構(gòu)，應(yīng)至少含有一個(gè)完好的標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶pst 因其會(huì)破壞標(biāo)記基因而不宜選擇。 所選限制酶切點(diǎn)不應(yīng)位于復(fù)制原點(diǎn)處以防破壞復(fù)制原點(diǎn)，如果所選酶的切點(diǎn)不止一個(gè)，則切割重組后可能會(huì)丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制，故不能選擇，如Xba。 所選限制酶，其切點(diǎn)應(yīng)位于啟動(dòng)子與終止子之間，如圖乙中Hind會(huì)破壞啟動(dòng)子，EcoR會(huì)破壞終止子，而Nde、BamH切出的切口可讓目的基因嵌入啟動(dòng)子與終止子之間,3)參加Ti質(zhì)粒的TDNA片段選擇限制酶 若質(zhì)粒上標(biāo)出TDNA片段，則所選限制酶切點(diǎn)應(yīng)位于TDNA片段中，從而有利于將目的基因嵌入到TD

3、NA片段上因?yàn)門i質(zhì)粒的TDNA片段最易轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，如用兩種限制酶Xba 和Sac (兩種酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，獲得含目的基因的片段。若利用該片段構(gòu)建基因表達(dá)載體，則下圖中甲、乙、丁，Ti質(zhì)粒均不宜選擇，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。(分析如下,2.目的基因的檢測(cè)與鑒定 (1)界定“標(biāo)記基因”與“DNA分子雜交技術(shù)”在目的基因檢測(cè)中的作用： 載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理 載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素

4、，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，倘若在選擇培養(yǎng)基中不能存活，則表明無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入，當(dāng)然不會(huì)有“目的基因”轉(zhuǎn)入，能存活時(shí)必含該載體，原理如下圖所示,標(biāo)記基因”篩選后為何還需應(yīng)用“DNA分子雜交技術(shù)”確認(rèn)目的基因是否轉(zhuǎn)入？ 經(jīng)上述步驟篩選得到的受體細(xì)胞，只是含特定的標(biāo)記基因的質(zhì)粒，然而，該質(zhì)粒上是否成功嵌入了目的基因，還不能確定，故仍需使用“目的基因”作探針，利用DNA分子雜交技術(shù)，檢測(cè)受體細(xì)胞的質(zhì)粒上是否含目的基因。 (2)使用“目的基因”作探針，運(yùn)用“分子雜交技術(shù)”檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出特定mRNA。 (3)采用“抗原抗體雜交技術(shù)”，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白

5、質(zhì)(作抗原)與相應(yīng)抗體雜交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認(rèn)目的基因是否“指導(dǎo)”特定蛋白質(zhì)的合成。 (4)采用抗蟲(chóng)、抗病毒等“接種實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行目的基因成功表達(dá)的“個(gè)體生物學(xué)”水平的檢測(cè),例證】 1.(2017北京卷，5)為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中,下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?) A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞 C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞 D.用DNA分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上 解析圖2中質(zhì)粒中

6、的抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰颍瑧?yīng)該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞，C錯(cuò)誤。 答案C,2.(2016全國(guó)卷，40)圖(a)中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoR、Sau3A的切點(diǎn)是唯一的,根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題： (1)經(jīng)BamH酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA分子，如圖(c)所示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有，不

7、能表達(dá)的原因是_,圖(c,3)DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，常見(jiàn)的有和，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_。 慧眼識(shí)圖獲取信息 (1)三種限制酶切割結(jié)果分析,2)表達(dá)載體與重組DNA分子分析,答案(1)Sau3A兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(3)EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶,1.(2019山東名校聯(lián)考)圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，ampr表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述正確的是(,A.圖

8、甲中的質(zhì)粒用BamH切割后，含有4個(gè)游離的磷酸基團(tuán) B.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用Pst和BamH切割質(zhì)粒和外源DNA C.用Pst和Hind酶切，可以保證重組DNA序列的唯一性 D.導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),解析圖甲中的質(zhì)粒只有一個(gè)BamH切割位點(diǎn)，切割后形成一個(gè)直鏈DNA，含2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，A錯(cuò)誤；BamH切割位點(diǎn)在目的基因上，不能用該酶切割外源DNA，B錯(cuò)誤；用Pst和Hind酶切，能將質(zhì)粒切成兩個(gè)片段，用Pst和Hind酶切，能將外源DNA切成三段，只有含目的基因的片段通過(guò)DNA連接酶與質(zhì)粒連接形成的重組質(zhì)粒符合要求，而另一個(gè)重組質(zhì)粒無(wú)目的基因，不符合要求，

9、從而保證重組DNA序列的唯一性，C正確；導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌，其重組質(zhì)粒是用Pst和Hind酶切割的，其中的ampr(氨芐青霉素抗性基因)已被破壞，D錯(cuò)誤。 答案C,2.(2019山東菏澤調(diào)研)科技人員通過(guò)基因工程、細(xì)胞融合等技術(shù)制作工程細(xì)胞，并利用工程細(xì)胞生產(chǎn)人們所需要的醫(yī)用蛋白，如用于治療糖尿病的胰島素。下面是利用大腸桿菌培育工程菌時(shí)用到的質(zhì)粒、胰島素基因及相關(guān)的限制酶。請(qǐng)回答： 表幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn),1)能識(shí)別人胰島素的mRNA并催化合成cDNA的酶是；利用PCR技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增所需要的酶是。在基因工程中，限制酶不能識(shí)別并切割單鏈核酸，其具體功能是_。 (2)上表中可

10、切割形成圖2胰島素基因末端的限制酶為；不宜選用Sau3A 限制酶切割質(zhì)粒的原因是_。 酶切后的質(zhì)粒與胰島素基因通過(guò)(填酶)作用后獲得基因表達(dá)載體,3)基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌前，常用Ca2處理菌體，其目的是_。 (4)從大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)獲得了胰島素，但其沒(méi)有降血糖的功能，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是_。 解析(2)根據(jù)胰島素基因末端序列可知，切割胰島素基因的限制酶識(shí)別和切割的序列為GATCC，表中的Sau3A可識(shí)別切割。分析表格信息可知，Sau3A限制酶可識(shí)別并切割Bgl或Bcl限制酶的識(shí)別序列，導(dǎo)致質(zhì)粒中的標(biāo)記基因均被破壞,答案(1)逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶或(Taq酶)識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷

11、酸序列并斷裂特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵 (2)Sau3ASau3A限制酶能識(shí)別并切割Bgl和Bcl限制酶的識(shí)別序列，導(dǎo)致質(zhì)粒中的標(biāo)記基因均被破壞(其他合理答案也可)DNA連接酶 (3)提高受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率(其他合理答案也可) (4)大腸桿菌為原核生物，細(xì)胞中只有核糖體，沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，不能對(duì)肽鏈進(jìn)行加工，形成有活性的胰島素,3.(2019?？谑匈|(zhì)檢)胰島素是治療糖尿病的重要藥物。現(xiàn)利用基因工程技術(shù)讓大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，下圖為大腸桿菌質(zhì)粒，請(qǐng)據(jù)圖作答,補(bǔ)充說(shuō)明：Hind、BamH、EcoR 是限制酶切位點(diǎn)tetR、ampR是抗生素抗性基因,1)獲取目的基因時(shí)，應(yīng)從人的文庫(kù)(基因組/cDNA)中獲取，這樣做的原因?yàn)?。獲取后不能直接對(duì)目的基因酶切，因?yàn)?，因此需要在目的基