碩士論文-SUFU和相關(guān)microRNAs在胰腺癌發(fā)病中的作用研究

1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文SUFU和相關(guān)microRNAs在胰腺癌發(fā)病中的作用研究姓名：王云鋒申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（消化系?。┲笇?dǎo)教師：高軍;李兆申20090501第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文二、人胰腺癌組織中表達與臨床和病理特征的相關(guān)性研究目的：在人胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中檢測蛋白的表達情況，分析胰腺癌組織中蛋白表達水平與胰腺癌患者臨床和病理特征的相關(guān)性。檢測胰腺癌細胞株中蛋白的表達情況。方法：收集年月年月長海醫(yī)院手術(shù)切除的例胰腺癌患者的胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織，同時收集患者臨床資料。所有病例均經(jīng)病理確診為胰腺導(dǎo)管腺癌。采用鏈霉素抗生物素一過氧化酶（，）免疫組織化學(xué)法檢測胰腺癌和相應(yīng)癌

2、旁組織中蛋白表達。細胞膜和細胞質(zhì)的棕黃色或棕褐色染色定位細胞染色陽性。光鏡下隨機計數(shù)個腫瘤細胞，計算染色陽性細胞所占的百分數(shù)，同時設(shè)定染色細胞的組織標本為蛋白表達陽性標本。結(jié)果：胰腺導(dǎo)管細胞癌的胞漿和胞核均可呈現(xiàn)蛋白染色。胰腺癌組織中（）存在的陽性表達，癌旁組織和正常胰腺組織中無蛋白陽性表達，兩者之間存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異（）。蛋白高表達與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移無關(guān)（），而與腫瘤的臨床分期呈顯著正相關(guān)。蛋白在胰腺癌細胞株和中表達陽性，蛋白定位在細胞核，細胞株胞核胞漿表達，一細胞株蛋白無表達。結(jié)論：的胰腺癌組織蛋白異常高表達，此高表達與患者的臨床分期呈正相關(guān)，提

3、示異常高表達參與胰腺癌發(fā)生和發(fā)展，為胰腺癌惡性特征之一。三、胰腺癌細胞株中相關(guān)表達的檢測及與其和蛋白表達的相關(guān)性分析目的：在四株胰腺癌細胞株中檢測相關(guān)（和）的表達，并分析、蛋白質(zhì)和相關(guān)表達的相關(guān)性。方法：應(yīng)用預(yù)測軟件篩選出與相關(guān)的的兩條，即、，利用實時定量法檢測株胰腺癌細胞株中、的表達，應(yīng)用統(tǒng)計軟件分析胰腺癌細胞株中、蛋白質(zhì)和相關(guān)表達的相關(guān)性。結(jié)果：各胰腺癌細胞株中和均高表達且程度不一，在胰腺癌細胞株中的表達依次為（），（士），（士）和（士），各組之間存在顯著差異（）。在胰腺癌細胞株中的表達依次為（），（士），（士）和（：），各組之間存在顯著差異（）。相關(guān)性統(tǒng)計和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究分

4、析發(fā)現(xiàn)，在細胞株中相對表達量與相對表達量呈正相關(guān)（，），而與蛋白表達程度存在一定負相關(guān)性（肛，），即在和一相對表達量較高的細胞中，蛋白表達陰性，提示干擾了的翻譯；在和相對表達量同時次之的和細胞中，蛋白僅胞核表達；在和相對表達量均較少的細胞中，蛋白胞漿和胞核均表達。結(jié)論：和在各胰腺癌細胞株均高表達，提示其在腫瘤發(fā)生中具有一定作用。但僅發(fā)現(xiàn)與相對表達量正相關(guān)，同時與蛋白表達負相關(guān)，提示僅具有對表達的調(diào)控。不同胰腺癌細胞株中的、蛋白質(zhì)及與的關(guān)聯(lián)性不盡相同，表明可能不同胰腺細胞株調(diào)控機制不盡相同，導(dǎo)致信號通路活化的機制不盡相同。關(guān)鍵詞：胰腺癌，通路，免疫組化第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文，曲，（），：（），

5、、一，（）（和，），一，、：，：，（，），：，（，）（，），（）（），、（），：，：，一：，、一，一，￥醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文：一，（），（），（）（士），（）（），（），（）（），（。）。（，），（，），和一，一；，和，；，和，：，一，一，一，一，：，和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究：礬印啊英文縮略語，（）衣吸光度值處吸光值處吸光值氨芐青霉素堿基對互補二氨基聯(lián)苯胺雙蒸水二乙基焦碳酸溴化乙淀乙二胺四乙酸異丙基硫代半乳糖苷微小信使核糖核酸磷酸鹽緩沖液多聚酶鏈式反應(yīng)干擾轉(zhuǎn)每分逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)十二烷基磺酸鈉棲熱水生菌聚合酶三羥甲基氨基甲烷溶液溴氫一吲哚一半乳糖獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個人

6、在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作。除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文使用授權(quán)書聲明本人完全了解第二軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)第二軍醫(yī)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：簽字日

7、期：年月日簽字日期：年月日第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文月舌胰腺癌是常見的高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢，在歐美國家中，胰腺癌的發(fā)病率每年為萬，據(jù)國內(nèi)上海市資料統(tǒng)計表明，年發(fā)病率已達到萬，近年發(fā)病率增加了倍。而且胰腺癌的惡性程度很高，我國胰腺癌死亡率已由癌癥死亡率的第位上升到第位（世界上為第位），在確診后只有的病例可進行手術(shù)根治，五年生存率低于，而以上的病人在確診后年內(nèi)死亡，即使經(jīng)過化療、內(nèi)照射等治療，中位生存期仍徘徊于個月。盡管手術(shù)切除仍是目前唯一有效的胰腺癌治療方法，但超過半數(shù)患者在確診時已經(jīng)局部或遠處轉(zhuǎn)移，同時術(shù)后復(fù)發(fā)也是導(dǎo)致存活率低的重要原因。因此，深入研究胰腺致病的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，

8、無疑對尋找胰腺癌新的分子預(yù)測標志和治療靶點有重要意義。信號通路活化在胚胎發(fā)育過程中是必須的，胚胎形成后，活性消失，但成體組織中其異常激活或成員突變可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。信號通路異常活化可由部分成員的突變或配體依賴性成員高表達所致。目前研究證實其通路異常激活與肺癌，消化道腫瘤，胰腺癌和前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。目前在消化道腫瘤發(fā)生中，信號通路主要以配體依賴性成員高表達發(fā)揮作用。成員突變參與皮膚，小腦和骨骼肌等處腫瘤的發(fā)生。信號通路婦配體、兩個跨膜蛋白受體和、下游轉(zhuǎn)錄因子蛋白等組成。在哺乳動物中存在種成員，且（）、（）及（），均為分泌性蛋白。和是位于細胞膜上的跨膜蛋白，其為的受體，能與三種蛋白（、和）結(jié)合。

9、當不存在蛋白時，抑鋁的活性，進而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。當?shù)鞍着c結(jié)合時，上的抑制效應(yīng)被解除，激活下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，即可誘導(dǎo)目標基因的表達。位于胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，不通過和，直接作用于調(diào)節(jié)活性。等【】研究發(fā)現(xiàn)株胰腺癌細胞系均表達，但只有部分胰腺癌細胞株對環(huán)杷明敏感，還有部分細胞株不敏感，這提示對環(huán)杷明不敏感的胰腺癌細胞可能是因下游通路某成員異常表達導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。作用靶點位于下游的因子。哺乳動物中抑癌基因是信號通路的主要負性調(diào)節(jié)因子。等利用干擾技術(shù)沉默后可充分激活介導(dǎo)的信號通路。目前文獻報道其可能通過兩種方式與相互作用：一，與在細胞質(zhì)中結(jié)合，從而抑制進入細胞核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性；二，在細胞核內(nèi)與其

10、他蛋白共同作用發(fā)揮的輔阻遏物作用。目前研究發(fā)現(xiàn)突變與髓母細胞瘤，基底細胞癌等發(fā)生有關(guān)；但在胰腺癌中未有其突變的報道。有報和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究道胰腺癌組織中、表達增高，而在胰腺癌中表達情況少見報道。微?。?，）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視，作為一種非編碼，主要影響基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過與的不完全互補結(jié)合影響癌基因或抑癌基因的表達，對基因表達起到負調(diào)控或基因沉默的作用。眾多研究表明，特異性的異常表達與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛在預(yù)測目標，并可作為干預(yù)治療的靶點。其廣泛存在于真核生物中，在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性。在生命活動中對生長、發(fā)育、

11、疾病等具有十分廣泛和重要的作用。最近研究顯示，人類不同腫瘤組織的表達不同。一些在腫瘤組織中低表達，大部分發(fā)揮抑癌基因的作用；相反，一些在腫瘤組織中高表達，發(fā)揮癌基因的作用。在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，預(yù)后，診斷和治療反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。的發(fā)現(xiàn)有助學(xué)者更進一步理解腫瘤發(fā)生實質(zhì)，但其可參與與多基因表達，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其龐大且復(fù)雜，對于靶點的鑒定及產(chǎn)生的生物學(xué)行為是目前科學(xué)研究的熱點與難點。近期研究發(fā)現(xiàn)也可通過通路參與胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，使通路更加復(fù)雜。通過調(diào)節(jié)斑馬魚肌細胞發(fā)育；通過參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長與血管形成過程。推測胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中也可能存在與特異之間相互作用?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀，本課題將

12、相關(guān)作為研究切入點，研究在胰腺癌組織中的表達情況及其與臨床和病理的相關(guān)性。研究相關(guān)在胰腺癌細胞株中的表達情況，為進一步實驗打下基礎(chǔ)。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文第一部分人胰腺癌組織中基因的表達是通路核心成員之一。近期文獻報道，在哺乳動物中抑癌基因是通路的主要負性調(diào)節(jié)因子。利用干擾技術(shù)沉默后可充分激活介導(dǎo)的信號通路。目前文獻報道其可能通過兩種方式與相互作用：與在細胞質(zhì)中結(jié)合，從而抑進入細胞核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性；在細胞核內(nèi)與其他蛋白共同作用發(fā)揮的輔阻遏物作用【】。有研究表明胰腺癌組織中、等表達增高，信號通路異常活化參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。目前尚沒有全面的檢狽在不同胰腺癌細胞株、胰腺癌組織和癌旁組織中表達的

13、報道。本實驗第一部分采用法（法）檢測胰腺癌細胞株、正常胰腺組織、胰腺癌組織與癌旁組織中的表達情況。一、材料和方法（一）材料、胰腺癌細胞株胰腺癌細胞系；購于美國公司，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有局部浸潤轉(zhuǎn)移能力。胰腺癌細胞系：德國市大學(xué)細胞生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所博士惠贈，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌伴肝轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化胰腺導(dǎo)管腺癌伴轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。、組織標本收集年月至年月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬

14、長海醫(yī)院胰腺外科接受手術(shù)治療的患者例，每例患者分別取胰腺癌和癌旁組織，在手術(shù)切除病灶后用鋒利刀片迅速切取原發(fā)腫瘤和切緣癌旁下常組織各塊，立即冷凍于液氮中保存，取材時間不超過。所有取標本的器械和凍存管均經(jīng)溶液隔夜浸泡處理并高壓滅菌。收集相應(yīng)病例手術(shù)記錄和臨床資料。所有病例均經(jīng)病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。同時，取我們實驗室保持的例正常胰腺組織作為對照（為意外死亡者的胰腺組織，和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究均取得家屬同意，并簽署書面知情同意書）。、主要試劑及主要試劑配制：）【日本生物有限公司美國公司胎牛血清美國公司小牛血清美國公司胰酶美國公司青霉素華北制藥股份有限公司鏈霉素上海四藥有限公司試劑美國公司氯

15、仿上海生物化學(xué)試劑公司異丙醇（）上海生物化學(xué)試劑公司華舜生物技術(shù)公司立陶宛公司酶北京博大泰克生物技術(shù)公司溴酚藍（）上海生工生物工程有限公司溴化乙錠（）上海華舜生物工程有限公司三羥甲基氨基甲烷（晡）上海生物化學(xué)試劑公司瓊脂糖（電泳級）上海藍季科技發(fā)展有限公司無水乙醇（）上海生物化學(xué)試劑公司上海天根生物工程有限公司乙二胺四乙酸二鈉（）美國公司蒸餾水與無菌雙蒸水本實驗室提供去離子水本實驗室提供生理鹽水、乙醇本實驗室提供：在去離子水中加入，過夜，高壓滅菌后即為水，儲存。酒精配制（水處理）：無水酒精中加入水，高壓滅菌后即為水處理過的酒精，室溫儲存。溶液的配制：稱取，加入去離子水，用磁力攪拌器持續(xù)攪拌使其

16、完全溶解后定容至，終濃度為，分裝于棕色小瓶內(nèi)，。保存。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文：準確稱取氯化鈉克、磷酸氫二鈉克、磷酸二氫鈉克和氯化鉀克，溶于三蒸水中，待完全溶解后用三蒸水定容至，高壓滅菌后冰箱保存。：準確稱加入雙蒸水，加熱攪拌溶解后，加入冰乙酸，加入（）用冰乙酸調(diào)至加雙蒸水定容至。瓊脂糖凝膠的配制：稱取瓊脂糖加入雙蒸水，再加入，加熱煮沸，然后加入，震蕩混均后倒入配膠槽中，冷卻凝固后將梳子拔出，即制成瓊脂糖凝膠。、主要儀器設(shè)備組織搗碎棒低溫高速離心機一及冰箱一低溫冰箱一全波長紫外可見光掃描分光光度計儀型水平電泳槽型紫外與可見分析裝置型電泳儀紫外透射儀與攝影設(shè)備顯微鏡及成像系統(tǒng)型電子天平梳板凍存管

17、、培養(yǎng)瓶微波爐型儀電熱干燥箱電熱恒溫箱微型漩渦混合儀恒溫孵箱光學(xué)顯微鏡一超凈臺上海華舜生物工程有限公司德國公司中國公司美國公司美國公司德國公司上海復(fù)日生物實驗技術(shù)研制所上海復(fù)日生物技術(shù)研制所電泳儀美國公司上海復(fù)同生物實驗技術(shù)研究所日本公司美國儀器公司上海復(fù)日生物實驗技術(shù)研制所美國公司廣東微波制品有限公司美國公司上海醫(yī)療器械總廠上海醫(yī)療器械七廠上海滬西分析儀器廠德國公司日本公司蘇州群眾醫(yī)電設(shè)備廠和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究頭（、）、小管（、）、管、聚丙稀管（）、及玻璃平、孑鋁質(zhì)金屬試管架、孔和孔塑料試管架、量筒（、）、燒杯、滴管、手套、酒精燈、三角燒瓶（、）以及樣品儲存盒均由本實驗室提供。（二

18、）方法、細胞培養(yǎng)采用貼壁細胞培養(yǎng)法，、。和胰腺癌細胞在含胎牛血清的培養(yǎng)液，（條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素各。、去除酶的方法塑料制品：在玻璃燒杯中注入去離子水，加入使其終濃度為；將待處理的塑料制品放入一鋁制飯盒內(nèi)，注入水溶液，使塑料制品的所有部分全部浸泡在溶液中；在通風(fēng)良好的室內(nèi)室溫處理過夜；將溶液小心倒入廢液瓶內(nèi)，。烘烤干燥，高壓滅菌，再次烘烤干燥，備用。玻璃和金屬制品：清洗干凈后烘烤。溶液：全部用去離子水配制，并按照的比例加入水處理過夜，高壓滅菌后儲存?zhèn)溆?。，、檢測的表達采用兩步法進行（如圖），首先進行全抽提，第一步進行逆轉(zhuǎn)錄，第二步得到后進行擴增。旺？孫瓶一，可篡藐。一一一！￥醫(yī)大

19、學(xué)碩士學(xué)位論文圖：兩步法流程圖、胰腺癌細胞株、胰腺組織總的抽提（）胰腺癌細胞株總的抽提用法抽提胰腺癌細胞中的總，具體步驟如下：常規(guī)培養(yǎng)細胞，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用將沖洗次上用的胰酶消化、吹打，。孵箱中放置，加含小牛血清的培養(yǎng)液中止、吹打細胞上轉(zhuǎn)至大離心管，、離心，棄上清加入，冰上放置上加入氯仿，充分混勻、，離心、將上清液小心轉(zhuǎn)移到無菌離心管中。）異丙醇，顛倒混勻，冰上放置，離心，棄上清；沉淀中加入乙醇。，離心，小心棄上清，放置超凈臺快速晾干，加入溶解沉淀，電泳及紫外分光光度計測定濃度及純度、將分管存放，冰箱保存?zhèn)溆茫ǎ┮认俳M織總的抽提和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究用法抽提胰腺組織中的總，具體

20、步驟如下：液氮中取出胰腺組織，放入研缽中研磨，注意邊研磨邊加入液氮將研碎的組織放入管中，加入上振蕩混勻，冰上放置、，離心（預(yù)冷離心機）取上清，轉(zhuǎn)至新的管加入氯仿，充分混勻上，離心將上清液小心轉(zhuǎn)移到無菌離心管中。加入異丙醇，顛倒混勻，冰上放置土，離心，棄上清；沉淀中加入，醇；上。，離心，小心棄上清，放置超凈臺快速晾干上加入溶解沉淀，電泳及紫外分光光度計測定濃度及純度上將分管存放，一。冰箱保存?zhèn)溆?、的鑒定取抽提的進行瓊脂糖凝膠電泳。用水調(diào)零后，將樣品取加在全波長紫外可見光掃描分光光度計的測樣臺上進行測量，記錄值及濃度。、逆轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)體系及條件如下：第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文水浴，混合液中加入“土混

21、勻，離心后。水浴上加逆轉(zhuǎn)錄酶（枷）水浴水?。ńK止反應(yīng)）上保存、逆轉(zhuǎn)錄的鑒定以基因設(shè)計引物進行，引物由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（見表）。表：引物序列反應(yīng)體系：和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究反應(yīng)條件：模板（）（）（）酶肛山共計山取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，如擴增出產(chǎn)物片段證實逆轉(zhuǎn)錄效率尚可，可用于以下實驗。、檢測胰腺癌細胞株和組織中的表達分別提取胰腺癌細胞株和胰腺組織總，反轉(zhuǎn)錄成，采用檢測的表達情況。引物和由上海生工生物工程公司協(xié)助合成（見表）。表：引物序列第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：共計山、數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用儀得到值，細胞株以為對照，組織標本以正常胰腺組織作為對照，通過以下?lián)Q算

22、得到相對表達量（值）。塹：一丟（珥一每一（強一怎水：必，一待測樣本，一內(nèi)參照和相關(guān)在胰腺癌發(fā)稿中的作用研究利用軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。所有數(shù)據(jù)輸入軟件。計量資料用坷或中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，用檢驗或檢驗。計數(shù)資料用，檢驗。為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。二、結(jié)果（一）總完整性、純度鑒定及濃度測定取“總樣品在瓊脂糖凝膠上電泳，可見三條清晰的條帶，分別為、及，無拖尾現(xiàn)象，表明抽提的總是完整的（見圖）。采用全波長紫外可見光掃描分光光度計測定總樣品，在之間，表明純度較高，無、蛋白質(zhì)等污染（見圖）。圖：代表性樣品濃度測定圖圖：代表性樣品濃度測定圖第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論王（二）逆轉(zhuǎn)錄效率的鑒定取逆轉(zhuǎn)錄為模板為引物進行普

23、通。取反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳（見圖）。圖：代表性樣品逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物電泳圖（三）產(chǎn)物序列分析以胰腺癌細胞株的為模板進行，產(chǎn)物電泳罔（見圖，）。產(chǎn)物大小為，產(chǎn)物送測序。測序結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物與中公布的基因序列匹配，兩者同源性均為（見圖）。圖：基因產(chǎn)物電泳圉圖：基因產(chǎn)物測序比對圖（四）檢測的表達本研究中擴增內(nèi)參照基因與基因分別得到擴增曲線與溶解曲線（見圖）。和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究曼。竺望苧竺擴增曲線溶解曲線溶解曲線圖：的擴增曲線（左）與溶解曲線（右）：內(nèi)參照：、胰腺癌細胞株中的表達胰腺癌細胞株值為基線，其余株胰腺癌細胞株與之相比得。通過運算得到兩組的值，在不同胰腺癌細胞株中表達水平（見圖，表

24、一）。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖：胰腺癌細胞相對表達量表：胰腺癌細胞相對表達量細胞株士士、胰腺組織中的表達以例正常胰腺組織平均值為對照，例胰腺癌患者癌組織和癌旁組織中與之相比得到，通過運算得到三組的值，為偏態(tài)分布，運用檢驗。胰腺癌組織組與癌旁組織中表達分別為和，無顯著性差異（見圖）。和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究圖：胰腺癌組織與癌旁組織中的相對表達量二、討論近年來，胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。大多數(shù)患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去根治性手術(shù)切除時機，且由于其轉(zhuǎn)移傾向以及對細胞毒性化療藥物耐受，各種傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、放療、化療及這些方法的聯(lián)合應(yīng)用均未能顯著改善患者的預(yù)后，年生存率低，預(yù)后極差。盡

25、管胰腺癌的發(fā)病形勢開益嚴峻，死亡率一直居高不下，但目前關(guān)于胰腺癌發(fā)病的分子機制還未完全闡明。大大限制了胰腺癌治療領(lǐng)域的發(fā)展。因此，迫切需要深入探討胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，以尋找早期診斷與治療胰腺癌的新途徑。信號通路的異常激活或部分成員突變對胰腺癌等腫瘤的發(fā)生和惡性生物學(xué)行為的維持極為重要。其首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，后在脊椎動物中證實，并進一步進行了深入研究。在胚胎發(fā)育時期，信號通路對許多發(fā)育過程是必須的，胚胎形成后，活性消失。但成體組織中其異常激活或成員突變可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前研究顯示通路異常激活與肺癌，消化道腫瘤，胰腺癌和前列腺癌有關(guān)；成員突變與來源于皮膚，小腦和骨骼肌的腫瘤有關(guān)。等口研究發(fā)

26、現(xiàn)株胰腺癌細胞系均表達，但只有部分胰腺癌細胞株對環(huán)杷明敏感，還有部分細胞株不敏感，這提示對環(huán)杷明不敏感的胰腺癌細胞可能是通過下游通路發(fā)生激活性突變而維持其增殖。作用靶點位于下游的因子。抑癌基因是信號通路重要成員之一，哺乳動物中其是通路的主要負性調(diào)節(jié)因子。等利第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文用干擾技術(shù)沉默后可充分激活介導(dǎo)的信號通路。目前文獻報道其可能通過兩種方式與相互作用：一，與在細胞質(zhì)中結(jié)合，從而抑制進入細胞核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性；二，在細胞核內(nèi)與其他蛋白共同作用發(fā)揮的輔阻遏物作用【。其突變與髓母細胞瘤，基底細胞癌等發(fā)生有關(guān)；但在胰腺癌中未有其突變的報道。有報道胰腺癌組織中、表達增高，而在胰腺癌組織細胞中

27、未見全面報道。本實驗研究表明胰腺癌組織與胰腺癌旁組織水平表達無顯著差異，說明胰腺癌在水平上未發(fā)揮作用，其參與胰腺癌進展可能在翻譯調(diào)節(jié)上有異常。和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究第二部分胰腺癌組織中蛋白表達與臨床病理間的相關(guān)性研究在哺乳動物中是通路的主要負性調(diào)節(jié)因子，其突變與髓母細胞瘤，基底細胞癌等發(fā)生有關(guān)；但在胰腺癌中未有其突變的報道。有報道胰腺癌組織中、表達增高，而關(guān)于蛋白表達情況目前研究較少。有研究顯示在胰腺癌組織中表達，胰腺癌細胞漿中與結(jié)合，競爭性抑制與結(jié)合，并且該研究指出參與且促進與的結(jié)合，從而使進入細胞核發(fā)揮作用，導(dǎo)致通路激活。另一研究顯示癌組織中高表達可能受通路激活的影響，或可能存在另

28、一條負反饋通路。本實驗研究采用免疫組織化學(xué)方法，檢測了胰腺導(dǎo)管腺癌（）和癌旁組織中蛋白表達，分析胰腺癌及癌旁組織中蛋白表達水平與臨床和病理間的相關(guān)性，探討在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用。一、材料和方法（一）材料、胰腺癌細胞株胰腺癌細胞系；購于美國公司，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有局部浸潤轉(zhuǎn)移能力。胰腺癌細胞系：德國市大學(xué)細胞生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所博士惠贈，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌伴肝轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化胰腺導(dǎo)管腺癌伴轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化

29、胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。組織標本收集年月，年月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胰腺外科接受手術(shù)治療的患者例，每例患者分別取胰腺癌和癌旁組織，同時收集相應(yīng)病例手術(shù)記錄和臨床資料。例患者術(shù)前均未行化療和放療。所有病例均經(jīng)病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論丈癌。其中男例，女例，年齡一歲，平均歲。所有病例均根據(jù)年國際抗癌協(xié)會（）的臨床分期標準。、主要試劑及主要試劑配制兔抗人多克隆抗體美國生物技術(shù)公司鼠抗人兔通用抗體上海長島抗體診斷試劑有限公司酶標二抗美國公司二甲苯上海試劑四廠昆山分廠無水乙醇上海振興化工一廠中性樹脂上海標本模型廠多聚賴氨酸抗體稀釋液上海長島抗體診斷試劑有限公司胎牛

30、血清美國公司一香港濃縮顯色試劑盒上海長島抗體診斷試劑有限公司甲醛上海生化試劑一廠過氧化氫上海遠大過氧化物有限公司磷酸氫二鈉上海生化試劑一廠磷酸二氫鈉上海生化試劑一廠氫氧化鈉上海生化試劑一廠氯化鈉上海生化試劑一廠氯化鉀上海生化試劑一廠蒸餾水與無菌雙蒸水本實驗室提供去離子水本實驗室提供生理鹽水、乙醇本院制劑室蘇木素、伊紅本院制劑室多聚賴氨酸：多聚賴氨酸原液用去離子水：稀釋后用于涂載玻片。磷酸鹽緩沖液（，）：準確稱取氯化鈉克、磷酸氫二鈉克、磷酸二氫鉀克和氯化鉀克，溶于去離子水中，待完全溶解后用去離子水定容至，稀釋使用。抗原修復(fù)液（）：取檸檬酸克加水至，取；檸檬酸三鈉取克加水至，取，兩者混合加水至即為

31、的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液。和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究胎牛血清：取胎牛血清，加，充分混勻。：，加雙蒸水，充分混勻。鹽酸乙醇：濃鹽酸加乙醇至，充分混勻。、主要儀器設(shè)備顯微鏡及成像系統(tǒng)微波爐組織切片機冰箱電熱干燥箱電熱恒溫箱一型生物組織包埋機生物組織自動脫水機其它設(shè)備同第一部分。（二）方法日本公司廣東微波制品有限公司德國公司中國公司上海醫(yī)療器械總廠上海醫(yī)療器械七廠湖北孝感亞光電子技術(shù)研究所湖北孝感亞光電子技術(shù)研究所、細胞爬片免疫細胞化學(xué)染色培養(yǎng)皿及蓋玻片涂多聚賴氨酸后置紫外線下消毒。鋪胰腺癌細胞株常規(guī)培養(yǎng)，爬片，置顯微鏡下觀察細胞密度為，一，終止培養(yǎng)，進行細胞免疫熒光染色，具體步驟如下：胰腺癌細胞

32、株常規(guī)培養(yǎng)，爬片上倒去培養(yǎng)液，洗次，各乙醇固定倒去乙醇，洗次，各破膜，洗次，各加一抗度冰箱過夜、洗次，各第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文加酶標二抗避光孵育洗次，各，甘油封片后置顯微鏡下觀察拍照、免疫組織化學(xué)染色手術(shù)切除標本置于甲醛中固定，脫水石蠟包埋，制成石蠟標本，切片，每一病例連續(xù)切片張，用于染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色采用鏈菌素親生物素（，）法檢測靶蛋白。抗體工作為濃度：。陰性對照用替代一抗，陽性對照采用卵巢癌標本。免疫組織化學(xué)染色流程脫蠟前，將組織切片在烘箱內(nèi)過夜烤片土組織片置于二甲苯中浸泡土更換二甲苯后再浸泡上在、的乙醇中依次浸泡洗次，各滴加在標本上，室溫洗次，各一、破膜，洗次，各

33、，檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，微波爐高火抗原修復(fù)洗次，各和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究滴加胎牛血清封閉液，室溫，甩去多余液體上合適稀釋度一抗度冰箱過夜洗次，各酶標二抗孵育（室溫）上洗次，各上顯色（液，液，雙蒸水），顯微鏡下觀察，合適時終止，一般秒蘇木素復(fù)染，自來水沖洗乙醇鹽酸分化，自來水沖洗返藍約上干燥后封片觀察、拍照（）結(jié)果判定定位于細胞膜和細胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色或棕褐色。光鏡下隨機計數(shù)個細胞，計算染色細胞所占的百分數(shù)。染色細胞為陽性。、統(tǒng)計學(xué)處理利用軟件。所有數(shù)據(jù)輸入系統(tǒng)。計量資料用石或中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，用，檢驗或檢驗。計數(shù)資料用矛檢驗。為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。一缸士甲一、二口木（一）蛋

34、白在胰腺癌細胞株中的表達蛋白在胰腺癌細胞株和中表達陽性，蛋白定位在細胞核；胰腺癌細胞株無表達；胰腺癌細胞株胞核胞漿表達。（見圖一，圖，圖，圖）第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文口口曳，圖：胰腺癌細胞株免疫細胞化學(xué)染色（）一鼉圖：胰腺癌細胞株免疫細胞化學(xué)染色（），雹十和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究甘：。毒，：躊二？孽圖：胰腺癌細胞株免疫細胞化學(xué)染色（）、參銹圖：胰腺癌細胞株免疫細胞化學(xué)染色（），、蛋第二軍醫(yī)走學(xué)碩士學(xué)位論文（）蛋自在胰腺癌組織中的表達手術(shù)切除標本石蠟標本行染色，確診為胰腺導(dǎo)管腺癌或無組織學(xué)改變的癌旁組織。在導(dǎo)管細胞癌細胞核染色，陽性細胞為棕黃色（見圖，圖，圖）。在非腫瘤細胞中偶見陽性細胞發(fā)

35、現(xiàn)胰島細胞可見陽性表達胰腺癌組表達陽性率，癌旁組織表達無陽性表達（見圖，圖）。圖：胰腺癌組織免疫組化圖（）圖；胰腺癌組織免疫組化圖（）和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究圖：胰腺癌組織免疫組化圖（）圖：胰腺癌旁組織免疫組化圖（）皆羹第二軍醫(yī)太學(xué)碩士學(xué)住論丈圖：正常胰腺組織免疫組化圖（）（三蛋白表達與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系為闡明胰腺癌組織表達和胰腺癌生物學(xué)特性間關(guān)系，我們比較了高表達組和低表達組臨床病理變量，（見表）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達強度和臨床分期（）相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤太小、淋巴轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移無關(guān)。表蛋白表達強度與胰腺癌患者臨床和病理參數(shù)的關(guān)系黼?yún)?shù)陽性薔達畔（）年齡（歲）野性別男跏

36、女腫瘤部位胰頭部體尾部腫瘤直徑和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究三、討論信號通路活化在胚胎發(fā)育過程中是必須的，胚胎形成后，活性消失，但成體組織中其異常激活或成員突變可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。信號通路異?；罨捎刹糠殖蓡T的突變或配體依賴性成員高表達所致。目前研究證實其通路異常激活與肺癌，消化道腫瘤，胰腺癌和前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。目前在消化道腫瘤發(fā)生中，信號通路主要以配體依賴性成員高表達發(fā)揮作用。成員突變參與皮膚，小腦和骨骼肌等處腫瘤的發(fā)生。信號通路由配體、兩個跨膜蛋白受體和、下游轉(zhuǎn)錄因子蛋白等組成。在哺乳動物中存在種成員，（）、（）及（），均為分泌性蛋白。和是位于細胞膜上的跨膜蛋白，其為的受體，能與三種蛋蘭（

37、、和）結(jié)合。當不存在蛋白時，抑鋁的活性，進而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。當?shù)鞍着c結(jié)合時，上的抑制效應(yīng)被解除，激活下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，即可誘導(dǎo)目標基因的表達。位于胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，不通過和，直接作用于調(diào)節(jié)活性【】。等乜研究發(fā)現(xiàn)株胰腺癌細胞系均表達，但只有部分胰腺癌細胞株對環(huán)杷明敏感，還有部分細胞株不敏感，這提示對環(huán)杷明不敏感的胰腺癌細胞可能是因下游通路某成員異常表達導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。作用靶點位于下游的因子。哺乳動物中抑癌基因是信號通路的主要負性調(diào)節(jié)因子。等利用干擾技術(shù)沉默第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文后可充分激活介導(dǎo)的信號通路。目前文獻報道其可能通過兩種方式與相互作用：一，與在細胞質(zhì)中結(jié)合，從而抑制進入細胞

38、核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性；二，在細胞核內(nèi)與其他蛋白共同作用發(fā)揮的輔阻遏物作用。目前研究發(fā)現(xiàn)突變與髓母細胞瘤，基底細胞癌等發(fā)生有關(guān)；但在胰腺癌中未有其突變的報道。等【】研究顯示在正常胰腺導(dǎo)管細胞中胞核表達，在癌前病變的導(dǎo)管細胞中胞核和胞漿表達，而在胰腺癌中細胞為胞漿表達，并且細胞漿中與結(jié)合，競爭性抑制與結(jié)合，從而使進入細胞核發(fā)揮作用，導(dǎo)致通路激活。苕等【】的研究提示可能受通路激活的影響，或可能存在另一條負反饋通路導(dǎo)致胰腺癌中表達增高。本研究在多個臨床病例樣本免疫組織化學(xué)檢測了蛋白，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織細胞的胞漿和胞核均有陽性表達，癌旁胰腺組織及正常胰腺組織中導(dǎo)管、腺泡和胰島未見蛋白表達。表達強度和臨床分期

39、相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移無關(guān)。提示其在胰腺癌組織中高表達為惡性表型之一，表明其在胰腺癌發(fā)病中具有一定作用。和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究第三部分胰腺癌細胞株中相關(guān)的表達及意義分析）一日舌是近期新發(fā)現(xiàn)的一類個核苷酸，非蛋白質(zhì)編碼的小家族。在基因轉(zhuǎn)錄后水平，通過與靶結(jié)合，對基因的表達起負性調(diào)節(jié)或基因沉默作用。其廣泛存在于真核生物中，在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性。在生命活動中對生長、發(fā)育、疾病等具有十分廣泛和重要的作用【】。最近研究顯示，人類不同腫瘤組織的表達不同。一些在腫瘤組織中低表達，大部分發(fā)揮抑癌基因的作用；相反，一些在腫瘤組織中高表達，發(fā)揮癌

40、基因的作用。在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，預(yù)后，診斷和治療反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。近年，和信號通路均是國內(nèi)外的研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)它們在腫瘤中起重要作用，因此針對它們作為診斷及治療靶點的研究亦是層出不窮。）等著名雜志研究發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)控調(diào)節(jié)胚胎生長發(fā)育和參與腫瘤的形成。最近幾項關(guān)于胰腺癌的研究，顯示胰腺癌有其特異性，是否存在胰腺癌相關(guān)調(diào)節(jié)從而影響腫瘤生長尚未有報道。本課題通過和等靶點預(yù)測軟件分析驗證、與的可能作用關(guān)系。目前研究顯示在多種腫瘤中高表達，提示其可能是腫瘤形成的重要因素，是目前研究的明星分子，其在炎癥，腫瘤，免疫中均發(fā)揮重要作用。有報道在胰腺癌抑制抑癌基因（）表達，從而促進胰腺癌細胞增則引。掣研

41、究提示參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。國內(nèi)有研究用一抑制劑干擾肺鱗癌細胞，實驗組明顯抑制了細胞增殖。有多項研究提示在胰腺癌中高表達，在腫瘤發(fā)生過程中起一定作用【。本實驗采用法（法）檢測胰腺癌細胞株中，的表達情況。分析各胰腺癌細胞株中、與之間是否可能存在作用關(guān)系。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文一、材料和方法（一）材料、胰腺癌細胞株胰腺癌細胞系；購于美國公司，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有局部浸潤轉(zhuǎn)移能力。胰腺癌細胞系：德國市大學(xué)細胞生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所博士惠贈，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌伴肝轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化胰腺導(dǎo)管腺

42、癌伴轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。（一）材料、胰腺癌細胞株胰腺癌細胞系；購于美國公司，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有局部浸潤轉(zhuǎn)移能力。胰腺癌細胞系：德國市大學(xué)細胞生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所博士惠贈，來源于一中度分化胰腺導(dǎo)管腺癌伴肝轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化胰腺導(dǎo)管腺癌伴轉(zhuǎn)移病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。胰腺癌細胞系：購自中國科學(xué)院細胞所，來自一低分化胰腺導(dǎo)管腺癌病人，其倍增時間為，具有轉(zhuǎn)移潛能。、主要試劑及主要

43、試劑配制胎牛血清小牛血清胰酶青霉素鏈霉素日本生物有限公司美國公司美國公司美國公司美國公司華北制藥股份有限公司上海四藥有限公司和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究試劑美國公司氯仿上海生物化學(xué)試劑公司異丙醇（）上海生物化學(xué)試劑公司華舜生物技術(shù)公司立陶宛公司酶北京博大泰克生物技術(shù)公司溴酚藍（）上海生工生物工程有限公司溴化乙錠（）上海華舜生物工程有限公司三羥甲基氨基甲烷（）上海生物化學(xué)試劑公司瓊脂糖（電泳級）上海藍季科技發(fā)展有限公司無水乙醇（）上海生物化學(xué)試劑公司上海天根生物工程有限公司乙二胺四乙酸二鈉（）美國公司蒸餾水與無菌雙蒸水本實驗室提供去離子水本實驗室提供生理鹽水、乙醇本實驗室提供：在去離子水中加入

44、，過夜，高壓滅菌后即為水，儲存。酒精配制（水處理）：無水酒精中加入水，高壓滅菌后即為水處理過的酒精，室溫儲存。溶液的配制：稱取，加入去離子水，用磁力攪拌器持續(xù)攪拌使其完全溶解后定容至，終濃度為，分裝于棕色小瓶內(nèi)，保存。：準確稱取氯化鈉克、磷酸氫二鈉克、磷酸二氫鈉克和氯化鉀克，溶于三蒸水中，待完全溶解后用三蒸水定容至，高壓滅菌后冰箱保存。：準確稱加入雙蒸水，加熱攪拌溶解后，加入冰乙酸，加入（）用冰乙酸調(diào)至加雙蒸水定容至。瓊脂糖凝膠的配制：稱取瓊脂糖加入雙蒸水，再加入，加熱煮沸，然后加入，震蕩混均后倒入配膠槽中，冷卻凝固后將梳子拔出，即制成瓊脂糖凝膠。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文、主要儀器設(shè)備組織搗碎

45、棒上海華舜生物工程有限公司低溫高速離心機德國公司之及冰箱中國公司低溫冰箱美國公司全波長紫可美國公司見光掃描分光光度計儀德國公司型水平電泳槽上海復(fù)日生物實驗技術(shù)研制所型紫外與可見分析裝置上海復(fù)日生物技術(shù)研制所電泳儀型電泳儀美國公司紫外透射儀與攝影設(shè)備上海復(fù)日生物實驗技術(shù)研究所顯微鏡及成像系統(tǒng)日本公司型電子天平美國儀器公司梳板上海復(fù)生物實驗技術(shù)研制所凍存管、培養(yǎng)瓶美國公司一微波爐廣東微波制品有限公司型儀美國公司電熱干燥箱上海醫(yī)療器械總廠電熱恒溫箱上海醫(yī)療器械七廠微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠恒溫孵箱德國公司光學(xué)顯微鏡日本公司超凈臺蘇州群眾醫(yī)電設(shè)備廠。頭（、）、小管（、）、管、聚丙稀管（）、及玻璃

46、平皿、孔鋁質(zhì)金屬試管架、孔和孔塑料試管架、量筒（、）、燒杯、滴管、手套、酒精燈、三角燒瓶（、）以及樣品儲存盒均由本實驗室提供。（二）方法、細胞培養(yǎng)采用貼壁細胞培養(yǎng)法，、和胰腺癌細胞和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究在含胎牛血清的培養(yǎng)液，條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素各，。、去除酶的方法塑料制品：在玻璃燒杯中注入去離子水，加入使其終濃度為；將待處理的塑料制品放入一鋁制飯盒內(nèi)，注入水溶液，使塑料制品的所有部分全部浸泡在溶液中；在通風(fēng)良好的室內(nèi)室溫處理過夜；將溶液小心倒入廢液瓶內(nèi)，烘烤干燥，高壓滅菌，再次烘烤干燥，備用。玻璃和金屬制品：清洗干凈后烘烤。溶液：全部用去離子水配制，并按照的比例加入水處

47、理過夜，高壓滅菌后儲存?zhèn)溆?。、檢測的表達采用兩步法進行（如圖），首先進行全抽提，第一步進行逆轉(zhuǎn)錄，第二步得到后進行擴增。秘啪咚忙時一可爨琶。一毒可闞一圖：兩步法流程圖第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文、胰腺癌細胞株、胰腺組織總的抽提胰腺癌細胞株總的抽提用法抽提胰腺癌細胞中的總，具體步驟如下：常規(guī)培養(yǎng)細胞、棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用將沖洗次上用的胰酶消化、吹打上孵箱中放置，加含小牛血清的培養(yǎng)液中止、吹打細胞轉(zhuǎn)至大離心管，。、離心，棄上清、加入，冰上放置土加入氯仿，充分混勻，。，離心將上清液小心轉(zhuǎn)移到無菌離心管中。加入異丙醇，顛倒混勻，冰上放置，。，離心，棄上清；沉淀中加入，醇。，離心，小心棄上清，放置超凈臺

48、快速晾干土加入溶解沉淀，電泳及紫外分光光度計測定濃度及純度，將分管存放，。冰箱保存?zhèn)溆?、的鑒定和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究取“抽提的進行瓊脂糖凝膠電泳。用水調(diào)零后，將樣品取加在全波長紫可見光掃描分光光度計的測樣臺上進行測量，記錄值及濃度。、逆轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)體系及條件如下：。水浴、【混合液山混勻，離心后水浴加逆轉(zhuǎn)錄酶（），水浴。水浴（終止反應(yīng)）保存、檢測細胞株、的表達分別提取胰腺癌細胞株和胰腺組織總，反轉(zhuǎn)染成，采用檢測和的表達情況。引物由本實驗室設(shè)計，由上海英俊生物工程公司協(xié)助合成（見表）。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文表：引物序列反應(yīng)體系：和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究反應(yīng)條件：廣：到匕劃吲叫礦、數(shù)

49、據(jù)統(tǒng)計利用儀得到值，細胞株以為對照，組織標本以正常胰腺組織作為對照，通過以下?lián)Q算得到相對表達量（值）。釁姆一蛾噼一咐一慨一蚴術(shù)趑木一待測樣本，屯，一內(nèi)參照利用軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。所有數(shù)據(jù)輸入軟件。計量資料用卻或中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，用，檢驗或檢驗。計數(shù)資料用，檢驗。為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。二、結(jié)果（一）總完整性、純度鑒定及濃度測定取總樣品在瓊脂糖凝膠上電泳，可見三條清晰的條帶，分別為、及，無拖尾現(xiàn)象，表明抽提的總是完整的（見圖）。采用全波長紫外可見光掃描分光光度計測定總樣品，在第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論王之間，表明純度較高，無、蛋白質(zhì)等污染（見圖）圖：代表性樣品總電泳圖鋱：對耀、惑？降勰、心凼矗由

50、小幽，；圖：代表性樣品濃度測定圖檢測胰腺癌細胞株的表達以細胞株的值為基線，株胰腺癌細胞株與之相比得。通過運算得到兩組的值，在不同胰腺癌細胞株中在水平。采用、一、和胰腺癌細胞株為對象，應(yīng)用法合成特異性引物，咀為內(nèi)參照，以低表達的細胞為對照，用技術(shù)檢測了上述細胞株中與胰腺癌相關(guān)的、和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究的表達（圖，圖）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同胰腺癌細胞株的相對表達量存在差異（圖），其中的表達最高（），其次（），二者均顯著高于細胞（，及叭）。此外，在中呈低表達（倍），而在中呈顯著高表達（倍，圖表）。鎏圖在不同胰腺癌細胞株的擴增和熔解曲線（熒光定量）圖在不同胰腺癌細胞株的擴增和熔解曲線（熒光定量）第二軍

51、醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖在不同胰腺癌細胞株中的表達（）圖在不同胰腺癌細胞株中的表達（）表一：五株胰腺癌細胞一相對表達量二、討論早在年，等在研究線蟲突變表型時，發(fā)現(xiàn)了第一個，其通過調(diào)節(jié)靶基因的翻譯來調(diào)控胚胎發(fā)育【。隨后多個研究小組相繼發(fā)現(xiàn)了大量類似的，于年統(tǒng)一命名為。一些在腫瘤組織中低表達，大部分發(fā)揮抑癌基因的作用；相反，一些在腫瘤組織中高表達，發(fā)揮癌基因的作用。成熟與靶互補位點結(jié)合通過兩種方式負性調(diào)節(jié)靶基因的表達。對靶基因抑制作用取決于與靶的互補程度。當與靶不完全匹配時通過基因沉默抑制靶基因表達；當與靶完全配對結(jié)合或幾乎完全配對結(jié)合時誘導(dǎo)靶的降解。在腫瘤的發(fā)生，進展，預(yù)后，診斷和評估治療反應(yīng)等方面

52、起重要作用。目前在胰腺癌診斷方面的研究較多：靶基因方面的研究，因為和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究與靶基因關(guān)系的復(fù)雜性，需更深入研究；年等【】研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織、癌旁組織、正常組織、胰腺癌細胞株及慢性胰腺炎組織的表達譜之間存在明顯不同，提示這些差異表達的也許能成為檢測胰腺癌的標記物或者治療靶標；原位進一步顯示、在胰腺癌細胞中表達，正常胰腺腺泡、間質(zhì)及導(dǎo)管上皮細胞不表達，表明與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)密切。隨后等【】研究顯示胰腺癌組織與癌旁組織、胰腺癌組織與慢性胰腺炎組織、慢性胰腺炎與癌旁組織表達譜不同，、在胰腺癌和慢性胰腺炎中相對高表達，可能提示其刺激腫瘤新生物的生長，或可能系炎癥因素干擾所致；研究

53、還發(fā)現(xiàn)與生存期明顯相關(guān)，表達增高的胰腺癌患者平均生存期僅為月，而低表達的患者平均生存期為月；但是不同實驗研究得出的表達譜結(jié)果差異較明顯，只有，共同存在。家族、等在其他腫瘤中廣泛報道，也參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展】。等【】利用人工合成的通過特異與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原（一）結(jié)合，成功抑制胰腺癌細胞的增殖。等瞵研究顯示胰腺癌中一抑制抑癌基因（）表達，從而促進胰腺癌細胞增殖。近期掣的研究表明姜黃素治療胰腺癌后改變了胰腺癌細胞的表達譜，藥物可通過調(diào)節(jié)發(fā)揮治療作用。最近，等【】研究證實檢測血漿（血清）用以腫瘤的診斷具有可行性，可嘗試用于胰腺癌早期診斷。最近幾項關(guān)于胰腺癌的研究，顯示胰腺癌有其特異性，是否存在胰腺癌

54、相關(guān)調(diào)節(jié)從而影響腫瘤生長尚未有報道。本課題根據(jù)已有幾項研究結(jié)果（包括）顯示的胰腺癌異常，通過預(yù)測的靶基因網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果，例如：；：；：等。篩選出可能受和（或）的調(diào)節(jié)（注：這些預(yù)測網(wǎng)站同時預(yù)測到它們之間的聯(lián)系）。本實驗研究提示胰腺癌細胞株水平表達差異不明顯，而免疫細胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)各胰腺癌細胞株蛋白水平表達有區(qū)別，實時定量檢測、顯示均高表達，提示其在腫瘤發(fā)生中具有一定作用。其中細胞株蛋白水平無表達，、高表達，結(jié)合和等靶點預(yù)測網(wǎng)站提示、可抑制蛋白表達。本實驗推測在胰腺癌細胞株中可能、抑制蛋白表達從而參第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文與胰腺癌的致病過程。但僅發(fā)現(xiàn)與相對表達量正相關(guān)，同時與蛋白表達負相關(guān)，提示可能

55、具有對表達的調(diào)控。在細胞株及臨床組織中與蛋白表達不一致可能是靶向的表達異常降低所致。不同胰腺癌細胞株中的、蛋白質(zhì)及與的關(guān)聯(lián)性不盡相同，表明可能不同胰腺細胞株調(diào)控機制不盡相同。和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究全文總結(jié)本實驗的基本內(nèi)容：利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測蛋白在胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺的表達情況，并進一步分析胰腺癌組織蛋白表達與患者臨床病理間的關(guān)系。利用實時定量方法檢測、及在胰腺癌細胞株中的相對表達量，利用免疫細胞化學(xué)檢測蛋白在胰腺癌細胞株的表達情況，分析各胰腺癌細胞株、表達與蛋白表達存在的可能關(guān)系。通過本實驗研究可以初步得到以下結(jié)論：在癌組織與癌旁組織中表達無顯著差異。多數(shù)胰腺癌細胞株（

56、）中蛋白異常高表達，約的胰腺癌組織蛋白也異常高表達，此高表達與患者的臨床分期呈正相關(guān)，表明蛋白異常高表達可能參與胰腺癌發(fā)生和發(fā)展，為胰腺癌惡性特征之一。相關(guān)和在各胰腺癌細胞株均高表達，表明其在腫瘤發(fā)生中可能具有一定作用。但僅發(fā)現(xiàn)與相對表達量正相關(guān)，同時與蛋白表達負相關(guān)，提示僅具有對表達的調(diào)控。不同胰腺癌細胞株中的、蛋白質(zhì)及與的關(guān)聯(lián)性不盡相同，表明在細胞株中可能通過抑制蛋白表達發(fā)揮致癌作用，在細胞株中與蛋白表達不一致可能是靶向的表達降低所致，不同胰腺細胞株調(diào)控機制不盡相同，導(dǎo)致信號通路活化的機制可能存在差異。本實驗的意義：明確了信號通路的主要負性調(diào)節(jié)因子在胰腺癌組織、癌旁組織和胰腺癌細胞株中和蛋

57、白水平的表達情況，明確和在各胰腺癌細胞株。發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織、癌旁組織和細胞株中蛋白水平表達不完全取決于水平，可能系因參與所致，為進一步實驗打下顰實基礎(chǔ)。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文附錄：綜述與胰腺癌王云鋒高軍李兆申是近期新發(fā)現(xiàn)的一類個核苷酸，非蛋白質(zhì)編碼的小家族。在基因轉(zhuǎn)錄后水平，通過與靶結(jié)合，對基因的表達起負性調(diào)節(jié)或基因沉默作用。廣泛存在于真核生物中，在物種問具有高度的保守性、時序性和組織特異性。在生命活動中對生長、發(fā)育、疾病等具有十分廣泛和重要的作用【。最近研究顯示，在腫瘤的形成及進展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。、：早在年，等【】在研究線蟲突變表型時，發(fā)現(xiàn)了第一個（），其通過調(diào)節(jié)靶基因的翻

58、譯來調(diào)控胚胎發(fā)育。隨后多個研究小組研究相繼發(fā)現(xiàn)了大量類似的，于年統(tǒng)一命名為，年獲得（）雜志十大科技突破第一名，逐漸成為研究焦點。近期研究表明，在各種疾病的發(fā)生，發(fā)展過程中均扮演重要角色。人類絕大多數(shù)位于編碼蛋白質(zhì)或非編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)含子區(qū)域，一些在基因組中有多個位點，也有串聯(lián)排列的。在細胞核內(nèi)由聚合酶或由聚合酶參與形成，般為數(shù)千堿基的長度，含有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾【。研被核酸內(nèi)切酶（）和雙鏈結(jié)合蛋白（）處理成約個核苷酸的莖一環(huán)結(jié)構(gòu)。由幣轉(zhuǎn)運蛋白將運輸?shù)桨|(zhì)，然后被聚合酶（）剪切成約個核苷酸的雙鏈。雙鏈進入誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（）中，一條鏈優(yōu)先保留在復(fù)合物中發(fā)展為成熟，另一條鏈則被降解。除了以上

59、合成方法，一些能繞過酶的處理，而是在酶的作用下生成【卜成熟與靶互補位點結(jié)合通過兩種方式負性調(diào)節(jié)靶基因的表達。對靶基因抑制作用取決于與靶的互補程度。當與靶不完全匹配時通過基因沉默抑制靶基因表達；當與靶完全配對結(jié)合或幾乎完全配對結(jié)合時誘導(dǎo)靶的降解【。但是，近期研究表明和靶基因部分互補也能夠?qū)е陆到?。二、研究方法：法：是研究真核細胞基因表達的基本方法，現(xiàn)在作為作者單位：上海，第二二軍醫(yī)大學(xué)附屬海醫(yī)院消化內(nèi)科通訊作者：李兆申，：和相關(guān)在胰腺癌發(fā)病中的作用研究腫瘤細胞中檢澳的標準方法，并常用來評價其它的檢測方法的可靠性【。法：實時（）也是研究在腫瘤表達及功能的基本方法之一。和聯(lián)合使用，是定量檢測的經(jīng)典方法?；蛐酒夹g(shù)：這一技術(shù)可以有效快捷地同時比較大量基因的表達情況，已在諸多實驗室用于的研究。計算機技術(shù)：可以預(yù)狽的靶基因，指導(dǎo)實驗。代表網(wǎng)站如：；：等。遺傳學(xué)方法：而反義抑制劑通過人工合成反義復(fù)合物，在體內(nèi)與競爭結(jié)合，從而發(fā)揮作用。點突變方法的可以直接研究與靶基因的相互作用。因為上有一些“種子序列”，對于和靶基因的結(jié)合是非常重要的，種子序列如果錯配，對的調(diào)控就會受到嚴重影響，從而影響生物性狀。其他研究方法還有轉(zhuǎn)基因、特異性引物等。三、與癌癥：近幾年研究顯示，人類不同腫瘤組織的表達不同。一些在腫瘤組織中低表達，大部分發(fā)揮抑癌基因的作用【；相反，一些在腫瘤組織中高表達，發(fā)揮癌基因的作用。在腫瘤