大規(guī)模細胞培養(yǎng)及發(fā)酵技術(shù)

1、大規(guī)模細胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵技術(shù),細胞培養(yǎng)的概述,動物細胞的特點： 無細胞壁 倍增時間長，生長緩慢 需氧量少，對攪拌敏感 聚集體形成 原代細胞培養(yǎng)50代即開始退化,動物細胞培養(yǎng)的概述,動物細胞培養(yǎng)的定義：動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù),動物細胞培養(yǎng)的概述,生長特性 貼壁生長型：如人胚肺細胞，Hela細胞，巨噬細胞，神經(jīng)細胞 懸浮生長型：如血液白細胞、淋巴細胞等,體外培養(yǎng)細胞的基本技術(shù),體外培養(yǎng)特點 體外培養(yǎng)工具 體外培養(yǎng)條件 體外細胞生長增殖過程 培養(yǎng)方法 大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù),體

2、外培養(yǎng)的特點,營養(yǎng)條件苛刻 適應(yīng)性差，敏感 培養(yǎng)時間長，易污染,體外培養(yǎng)的條件,溫度，37 pH：7.2-7.4 氣體：氧，二氧化碳，氮氣 營養(yǎng)條件：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可由血清提供,細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù),細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法,反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) 容易換液，不需特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可采用灌流培養(yǎng)獲得高密度，但擴大規(guī)模較難，適合制備量小，價值高的生物藥品。（CelliGen PlusTM） 微載體培養(yǎng) 最有前途的動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，易于放大。（Cytodex，Cytopore和Cytoline） 無血清

3、懸浮培養(yǎng) 用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養(yǎng)技術(shù),動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中重要參數(shù),pH 溶氧 溫度 谷氨酸/谷氨酰胺 葡萄糖 乳酸 CO2,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中重要參數(shù),NH4+ K+/Na+ Ca+ 滲透壓 細胞密度,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問題,細胞凋亡 細胞在高密度條件下，由于細胞的多層生長，存在細胞接觸抑制效應(yīng)，細胞的生長和表達均受到嚴重影響,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問題,細胞凋亡主要是細胞生長的條件較惡劣，包括： 1.營養(yǎng)缺乏 2.有害代謝產(chǎn)物的積累 3.pH和溶氧控制不當(dāng) 4.機械攪拌剪切力較大 5.滲透壓,細胞大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用,生產(chǎn)疫苗 蛋白質(zhì)和多肽

4、藥物 基因治療 單抗,微生物培養(yǎng)技術(shù),概述 傳統(tǒng)：釀酒、抗生素、制醋 基因工程：生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物、疫苗等（大腸桿菌、酵母） 一般采用高密度發(fā)酵技術(shù),微生物培養(yǎng),培養(yǎng)過程決定于： 菌種 培養(yǎng)條件,微生物培養(yǎng)過程重要參數(shù)： 溫度 pH 溶氧 葡萄糖/甘油 乙酸,乳酸 NH4+ 磷酸鹽 乙醇(酵母) 甲醇(酵母) 細胞密度,微生物高密度培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)基 表達基因的調(diào)控 宿主菌 質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性,高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵是發(fā)酵的補料控制,根據(jù)重組菌的生長特點及產(chǎn)物的表達方式采取合理的營養(yǎng)物質(zhì)的流加方式 恒速流加 變速流加 指數(shù)流加,微生物高密度培養(yǎng)乙酸的形成:培養(yǎng)液中葡萄糖的含量超過菌體生長所需量或在缺氧的

5、情況下,便會大量產(chǎn)生乙酸. 減少乙酸的策略: 限制性流加葡萄糖 甘油代替葡萄糖 降低培養(yǎng)溫度,宿主菌 降低比生長速率 透析培養(yǎng),細胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵中的重要參數(shù),了解生物技術(shù)的應(yīng)用,Glucose,Glutamine,Ammonia,Lactate,pH,不同的細胞具有不同最佳 pH范圍 pH 能影響葡萄糖和谷氨酰胺的代謝，在低pH條件下，葡萄糖消耗速度慢 pH能影響細胞的生長和目標(biāo)產(chǎn)物的量,CO2,在細胞培養(yǎng)過程中，CO2 與碳酸氫鹽形成緩沖對，穩(wěn)定培養(yǎng)液中的 pH CO2也可用于計算呼吸商，反應(yīng)細胞活力和代謝旺盛程度 細胞代謝（呼吸作用）會產(chǎn)生CO2 (廢物) CO2 水平增加會抑制細胞生

6、長和細胞活性，從而影響目標(biāo)蛋白的表達，當(dāng)溶液中CO2達到14-15%時，會嚴重抑制細胞的生長,CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3,DO(溶氧,葡萄糖等需氧來氧化產(chǎn)生ATP供細胞的能量 用于測量和跟蹤細胞消耗氧的速率,溶氧,在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，O2 通常是限制營養(yǎng)成分，是因為它在溶液中低溶解度: 通常關(guān)心對培養(yǎng)液中 % O2, 也就是“溶氧” 值 (DO): 理論DO: 80% +/- 5 % (哺乳動物細胞培養(yǎng)) 90 % DO2 (細菌培養(yǎng)） O2 也可能通過自由基形成對細胞造成傷害,在低pO2 水平，細胞的活性通常越高 (O2 值必須維持在最低的水平) 然而, 原代細胞

7、可能在低 O2 條件下繁殖受延遲 因而，維持正確的O2的平衡，對保證所有細胞正確生長都非常重要,一般30-50,葡萄糖,葡萄糖兩個主要的功能: 細胞的主要的能量物質(zhì) 主要的細胞碳源 葡萄糖和谷氨酰胺是相互補充的: 產(chǎn)生其他代謝物 (例如: 天冬氨酸) 提供能量 在所有細胞中通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)變成丙酮. 葡萄糖的代謝隨細胞生長而增加. 葡萄糖通常是細胞生長的限制因素,葡萄糖,監(jiān)控細胞反應(yīng)器和發(fā)酵罐中的葡萄糖水平: 保證細胞正常生長所需能量. 開發(fā)延長細胞培養(yǎng)周期的標(biāo)準(zhǔn)補料策略. 計算葡萄糖消耗速率和決定批次培養(yǎng)最佳的起始濃度,乳酸= 氧化問題,在培養(yǎng)過程中，大多數(shù)乳酸來自于葡萄糖代謝，但也有一部分

8、來自于谷氨酰胺代謝. 基于高細胞密度和深液位，氧的消耗非常大. 典型的范圍 (組織培養(yǎng)): 0 - 5 g/L O2 消耗導(dǎo)致乳酸的形成，最終導(dǎo)致pH的下降. 對恒定的 pH:抑制細胞生長的乳酸水平在低到 4 mM 到高達 70 mM (取決于細胞). 在大多數(shù)情況下，銨對細胞生長的抑制比乳酸更嚴重,乳酸,監(jiān)控長時間細胞培養(yǎng)中乳酸的積累. 計算乳酸產(chǎn)量與葡萄糖的消耗之間的代謝關(guān)系 考察乳酸鹽對細胞表達產(chǎn)物的毒害影響,銨,細胞培養(yǎng)和發(fā)酵中銨的來源: 主要來源: 代謝谷氨酰胺(谷氨酰胺降解) 谷氨酰胺降解成銨和吡咯烷酮酸 其他氨基酸的脫氨基作用 銨的水平也取決于細胞密度和細胞代謝方式. 引起細胞抑

9、制的銨離子濃度范圍: 從:0.5 mM (L Mouse Cells) 到:40.0 mM (M. Ascites Tumor Cells)(不同的細胞株對銨有不同的耐受度,銨,pH 會受 NH3增加的影響:NH4+ NH3 + H + 銨的增加也會改變細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運動.監(jiān)控發(fā)酵罐和生物反應(yīng)器中銨的水平（廢物）. 推算谷胺酰胺的降解水平. 考察銨濃度對細胞密度和產(chǎn)物濃度的影響. 監(jiān)控引入培養(yǎng)基的質(zhì)量,限制銨抑制的策略,增加換液的速率 (補料). 維持培養(yǎng)液中低的谷氨酰銨濃度減少其轉(zhuǎn)化和降解. 在低的 pH培養(yǎng)減少NH3形成. 去除培養(yǎng)液中的銨: 酶轉(zhuǎn)化 通過特殊的 “PTFE” 膜將 NH3

10、 擴散到低pH 溶液中 使用能夠逐步接受高 NH3 濃度的細胞,谷氨酰胺,與葡萄糖一樣, 谷氨酰胺也是細胞的主要物質(zhì):* 碳和氮* 能量 谷氨酰胺通常被認為是細胞培養(yǎng)的主要限制營養(yǎng) 谷氨酰胺是生物合成的前體物質(zhì): * 嘌呤* 嘌呤核苷 谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受體,谷氨酰胺,監(jiān)控谷氨酰胺的水平: 確保細胞生長所需的能量. 開發(fā)長時間細胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化補料策略. 計算谷氨酰胺的消耗速率和決定批次培養(yǎng)最佳的其始濃度,谷氨酸,需用來計算谷氨酰胺 需確證谷氨酸 的濃度，確保沒加進谷氨酰胺結(jié)果. 谷氨酰胺的降解產(chǎn)物,Na/K,Na-K: 對合適培養(yǎng)基生產(chǎn)很重要. 維持溶液/培養(yǎng)基合適的離子強度,滲透壓,滲透壓是溶液濃度的一個反應(yīng): 測定滲透壓的參考方法是使用滲透壓計 典型細胞培養(yǎng)液滲透壓值:300 +/-30 mOsmol/kg. 滲透壓升高 50-100 mOsmol/kg 會明顯影響某些細胞的生長. 某些溶液/化合物可作為滲透壓的保護劑 (維持滲透壓穩(wěn)定和更低). 這些物質(zhì): 甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸,滲透壓,用于對引進的培養(yǎng)基進行質(zhì)量控制 關(guān)聯(lián)滲透壓與細胞數(shù)、細胞活性和產(chǎn)量的關(guān)系 監(jiān)控連續(xù)補加營養(yǎng)引起滲透壓的增加,細胞密度,細胞密度通常等于 “生物量” 它是指給定體積的細胞數(shù)，可