質粒提取寶典

1、第一部分 堿裂解法提取質粒,一、實驗目的,通過本實驗學習和掌握堿裂解法提取質粒,提純的思路,質粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA 要去除的物質： 蛋白 基因組DNA 脂類及小分子雜質 RNA,二、實驗原理,堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質粒與線性染色質在拓撲學上的差異來分離它們，在堿性pH，DNA變性，恢復中性時，線性染色體DNA不能準確復性，與其它大分子共沉淀，而質粒DNA卻可以準確復性，留在上清中。 堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質粒的方法都用到質粒DNA分子相對較小和共價閉合環(huán)狀這兩個特性。由于操作原因提取的質?？捎腥N結構：超螺旋、開環(huán)和

2、復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起,三、實驗儀器、材料與試劑,一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、臺式離心機、高壓滅菌鍋 （二）材料：含有質粒的大腸桿菌、LB液體培養(yǎng)基 （三）試劑： 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTrisHCl（pH8.0）10mM EDTA 作用:分散細胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鮮配制） 作用:細胞壁肽聚糖堿性下水解,核酸和蛋白質變性。 溶液III 5M KAC 作用:酸性下質粒DNA復性，變性蛋白SDS線性DNA沉淀， K可中和DNA,平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白質變性并有助于液相與

3、有機相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫） 注：用時取下層液，酚腐蝕性強，可引起灼傷。 無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀 TE緩沖液：溶解DNA,三、實驗儀器、材料與試劑,1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g離心30秒。 2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 3、菌體沉淀重懸浮于100l溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。 4、加入新配制的200l溶液, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰

4、浴5分鐘。 5、加入150l預冷的溶液,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4下12000g離心5-10分鐘,四、操作步驟,四、操作步驟,6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4下12000g離心5分鐘。 7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12000g離心10分鐘。 8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g離心5-10分鐘。 9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥

5、10分鐘或室溫干燥。 10、將沉淀溶于20l TE緩沖液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，儲于-20冰箱中,堿裂解法流程圖,對數(shù)期菌體,溶液III中和,溶液I充分重懸,溶液II裂解,上清液,抽提,離心洗滌,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,質粒DNA溶液,五、注意事項材料準備,使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加） 培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失 盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量 菌株不要頻繁轉接（質粒丟失,五、注意事項細胞裂解,菌體量適當。 培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮。 變性的時間不要過長（5分鐘），否則質

6、粒易被打斷。 復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染。 G菌、酵母質粒的提取，應先用酶法或機械法處理，以破壁,五、注意事項核酸分離、純化,采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系 采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔 離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法,五、注意事項核酸沉淀、溶解,當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分 沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后應用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期

7、儲存建議使用TE緩沖液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解,菌體老化 堿裂解不充分 菌體中無質粒 溶液使用不當,請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng) 可減少菌體用量或增加溶液的用量 不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。 溶液在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，置于37保溫片刻直至溶解為清亮的溶液,六、質粒DNA提取常見問題,問題一：未提出質?；蛸|粒得率較低，如何解決,原因,對 策,混有蛋白 混有RNA 混有基因組DNA,不要使用過多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質 加入RNaseA室溫放置一段時間 加入溶液II 和III后防止劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質粒中。細菌培養(yǎng)時間過長會導致細胞和DNA的降解，培養(yǎng)時間不要超過16小時,六、質粒DN