模板DNA的提取

1、分子生物學實驗,1、 歡迎大家參加分生實驗的學習； 2、 學習分生實驗的重要性； 3、 守紀律，聽老師安排，穿白衣； 4、 每組做一份實驗 4、 本課件禁止拷貝，同學們要作好記錄; 5、 關于課間休息和上課時間 實驗結(jié)束后主動整理實驗臺,實驗一 基因組DNA的提取 實驗二 PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測 實驗三 RFLP 實驗四 RNA提取 實驗五 TA連接 實驗六 轉(zhuǎn)化 實驗七 質(zhì)粒的提取、酶切鑒定,實驗課安排,1. 目的 DNA片段,質(zhì)粒,TA載體,5.連接,重組質(zhì)粒,目的 DNA,6.轉(zhuǎn)化,無質(zhì)粒的E.Coli 死亡,有質(zhì)粒的E.Coli 存活,含抗生素培養(yǎng)基中生長,2. PCR,2-3mi

2、n,平板篩選,實驗課安排,質(zhì)粒提取,7. 酶切,實驗報告要求,最后2學時進行實驗課考試(20分) 開卷, 但不許抄襲其它同學試卷。 內(nèi)容為兩個實驗： 實驗目的、主要步驟、 結(jié)果（畫圖）、結(jié)果分析 4. 收卷時簽名,一、加樣器的使用及注意事項 1、 用途 2、 如何使用,2.1 根據(jù)取樣量，選擇合適的加樣器。 5ul、50ul、500ul，應選擇哪個加樣器,頂部標有加樣器的最大量程， 分別為： 20ul: 0.5 20 l 100/200ul: 20 100/200 l 1000ul: 200ul 1000 l,實驗儀器的使用及注意事項,練習：加樣器讀數(shù)為 100，實際體積各為多少,2.2 如何

3、調(diào)節(jié),1)首先觀察目前讀數(shù),假設為050: 1000 l: 500 l 100/200 l: 50 l 20 l： 5 l (2) 順時針調(diào)節(jié)- 讀數(shù)變小 逆時針調(diào)節(jié)- 讀數(shù)變大 (3)注意：調(diào)節(jié)前加樣器讀數(shù)正處于最大量程或最小量程時，如果向錯誤方向調(diào)節(jié)，馬上會超出量程，將會損害加樣器的精度,2.3 加樣器使用步驟(示教及學生練習)： 1）選擇加樣器,觀察讀數(shù),調(diào)節(jié)讀數(shù)，吸頭的安裝要緊密。 不要用手直接拿吸頭，安上吸頭后一定要再固定一下。 2）吸取液體前，先打到第一擋。 3）將吸頭插入液面下適當深度， 過深可能會腐蝕加樣器, 過淺可能會吸入空氣。 4）緩慢松開拇指,吸取液體。松開過快，液體上沖

4、會腐蝕加樣器;完全放開拇指后，停留約半秒鐘, 急于離開液面，容易吸入空氣。 5）抬起加樣器,估計體積是否正確,將外壁液體用容器口引流回去 6）(吸頭內(nèi)有液體時，不能將加樣器倒置或平放，以防液體倒流損壞加樣器！),貼容器內(nèi)壁，將液體勻速打出，加樣器推到第二擋。 觀察吸頭內(nèi)液體是否完全打出并立即棄于廢物盒內(nèi),1、打開電源 2、離心管中的液體為2/3,蓋緊蓋子,防止離心機被腐蝕,二、離心機的使用注意事項,1代表轉(zhuǎn)速盤上方的數(shù)據(jù)，2代表下方的數(shù)據(jù),3、樣品配平, 對稱放入離心機(管的連接處朝外). 4、設定離心時間(如設定2分鐘，可定時多點時間，再用手表記時)。 5、統(tǒng)一離心，逐漸升到要求轉(zhuǎn)速,實驗一

5、、真核生物基因組DNA的 提取、電泳,高等生物的基因組相當寵大。 真核細胞基因組約含萬個結(jié)構基因，其它大量存在的是調(diào)控序列和內(nèi)含子序列?？梢哉f某特定物種的基因組，包含了該物種生長，發(fā)育，繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量，因而對真核細胞基因組的結(jié)構，組成，以及表達調(diào)控的研究是至關重要的 而研究的起點就是要獲得純度高不含蛋白質(zhì)、糖類、酚、氯仿等污染；得率好以便有足夠量用于分析；基因組相對完整斷裂的基因組以便用于以后分析，RFLP分析，基因文庫的構建，基因探測等的研究,一、 實驗背景,掌握小鼠肝臟組織模板DNA的提取技術。 學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和技術,第一部分 ：肝組織制備、蛋白酶k消化

6、 第二部分: 酚氯仿抽提、乙醇沉淀 第三部分： DNA瓊脂糖、凝膠電泳,三、實驗材料 小鼠肝臟組織,四、主要試劑（稍后講解,二、 實驗目的,五、實驗步驟（馬上講解,五、實驗步驟,加樣器使用提示： （1）吸頭的安裝要緊密。 （2）打到第一擋，將吸頭插入液面下適當深度（3）緩慢松開拇指，吸取液體。拇指完全放開后，吸頭在液面下停留一下（約半秒鐘）（4）將外壁液體用容器口引流回容器。吸頭內(nèi)的體積應大致正確。（5）貼目的容器內(nèi)壁，將液體勻速打到目的容器內(nèi)，加樣器推到第二擋。觀察吸頭內(nèi)液體是否完全打出,1. 取新鮮小鼠肝組織（約300500mg），組織塊不 宜過大, 放在毛玻璃片上立即研磨,研磨要徹底。

7、2. 將研磨后的肝組織轉(zhuǎn)移至加有460 l NE溶液的EP管中，混勻,實驗第一部分 小鼠肝組織的制備、蛋白酶K消化,注意事項 （1）組織磨得越細越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于細胞中含有大量的DNA酶，因此，第一步的操作（EDTA：抑制酶活性）應迅速，以免細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解,操作注意事項： 1、離心時離心機內(nèi)樣品平衡后對稱放置 2、注意30ul、50ul加樣體積準確,加樣器使用提示： （1）吸頭的安裝要緊密。 （2）打到第一擋，將吸頭插入液面下適當深度（3）緩慢松開拇指，吸取液體。拇指完全放開后，吸頭在液面下停留一下（約半秒鐘）（4）將外壁液體用容器口引流回容器。吸

8、頭內(nèi)的體積應大致正確。（5）貼目的容器內(nèi)壁，將液體勻速打到目的容器內(nèi)，加樣器推到第二擋。觀察吸頭內(nèi)液體是否完全打出,1000 r/m,離心5min (統(tǒng)一離心)，將上層細胞懸液轉(zhuǎn)移至另一EP管中，用NE溶液補足至500 l，棄掉下層大塊的組織沉淀。 4. 加30 l 10%SDS, 迅速混勻。 5. 加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混勻，置50水浴50min,一、核酸提取的主要步驟,課間介紹,真核細胞基因組在提取過程中一般有以下幾步: 1) 破碎細胞； 2) 去除蛋白質(zhì)，糖類等等生物大分子；由于真核細胞基因組較大，在純化出的的操作中應注意動作輕柔，且在低溫下進行，以最大限度地減少機械和

9、化學作用對的剪切，從而獲得相對完整的 3) 沉淀核酸,乙醇沉淀,SDS裂解 蛋白酶K消化,瓊脂糖電泳,PCR,DNA提取步驟圖解,酚氯仿抽提,作用：a. 陰離子型去污劑，溶解細胞膜、核膜上脂質(zhì)成分 b.使蛋白質(zhì)變性 c.將細胞膜、核膜破壞；對核酸酶有抑制作用,N: NaCl 50mM E: EDTA.Na2 25mM (PH:8.0) 作用： 金屬離子螯合劑，抑制DNase的活性 (螯合DNase發(fā)揮活性所需的2價陽離子,二、各種試劑的作用,1、NE 溶液,2、SDS ：十二烷基硫酸鈉 終濃度0.5,3、蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶,是廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白

10、質(zhì)，將DNA游離,重蒸酚: 酚的作用是變性蛋白質(zhì)，而對DNA結(jié)構沒有影響。 本身無色 酚的氧化產(chǎn)物(如醌等,粉紅色) 破壞磷酸二脂鍵。 重蒸酚是將酚中的酚的氧化產(chǎn)物去除。 TE溶液 : Tris-HCl 10mM (pH:8.0) EDTA.Na2 1mM (pH:8.0) 作用： 提供略堿的pH值，保證DNA溶于水相。 在酸性條件下，DNA分配于有機相。 8-羥基喹啉： 0.1% 黃色 酚相指示劑、抗氧化劑,作用： 去除蛋白等雜質(zhì)。酚對蛋白有強烈的變性作用，用酚和氯仿抽提樣品，可以使樣品中的蛋白質(zhì)變性沉淀，可通過離心去除。為防止其對后續(xù)實驗的影響，一般再用氯仿抽提去除殘留的酚,4、TE飽和重

11、蒸苯酚,氯仿作用： a. 氯仿的變性作用不如酚好， 但與酚共同/交替使用可增強去蛋白效果； b. 氯仿有加速有機相和水相的分離、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性,5、酚/氯仿,6、氯仿/異戊醇 ( 24 : 1,氯仿的作用： 去除DNA水溶液中殘留的微量酚。 異戊醇的作用：減少操作過程中氣泡的產(chǎn)生,在單價陽離子存在的情況下，乙醇可以使DNA發(fā)生沉淀?？呻x心收集 . 核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，能與很多陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機溶劑中不溶解，也不會被變性。 最常用沉淀劑為1價鈉、鉀、胺和鋰等離子的鹽類，如醋酸鈉、NaCl、氯化鋰、氯化鉀等 常用有機沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二

12、醇、精胺等,8、無水乙醇,作用：提供單價陽離子,7、醋酸鈉：3M NaAc pH: 5.2,課間休息,同學自己練習,加樣器使用提示： （1）吸頭的安裝要緊密。 （2）打到第一擋，將吸頭插入液面下適當深度（3）緩慢松開拇指，吸取液體。拇指完全放開后，吸頭在液面下停留一下（約半秒鐘）（4）將外壁液體用容器口引流回容器。吸頭內(nèi)的體積應大致正確。（5）貼目的容器內(nèi)壁，將液體勻速打到目的容器內(nèi)，加樣器推到第二擋。觀察吸頭內(nèi)液體是否完全打出,十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。蛋白酶K

13、作用是降解蛋白質(zhì)。 再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。 上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液,1、加入550ul(等體積)TE飽和酚, 混勻1min. 10,000rpm, 2 min。 (注意抽取下層酚相; 酚可腐蝕加樣器等, 加樣器頭用過即棄掉) (輕柔混勻，避免DNA鏈斷裂; 但是太輕又起不到變性蛋白的作用) 2、將上層水相移至一新管中 (要盡量抽盡，又不可吸起酚相)。 加入500ul(等體積)酚/氯仿 (已經(jīng)配好，體積比1:1),

14、同上條件混勻后離心。 3、 將上層水相移至一新管中。 加入500ul(等體積)氯仿-異戊醇，同上條件離心、取上清。 4、加入1/10體積（約30ul）醋酸鈉于上清中充分混勻。 5、加入2-2.5倍體積（約1ml）無水乙醇（通常加滿小離心管）， 混勻后交給老師，（統(tǒng)一置）-20 1 h ( 或-70 10 min,實驗第二部分、 酚氯仿抽提及乙醇沉淀,注意事項： 1） 本實驗將用到的TE飽和重蒸苯酚、氯仿/異戊醇是有機試劑，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我們總是取上清； 2） 在抽取完苯酚、氯仿等有機試劑尤其不能將加樣器平放或倒置，以防液體導流損壞加樣器，加完樣后立即棄掉加樣器頭。 3） 基

15、因組DNA由于太大，非常容易受機械剪切而斷裂，因此，為了得到完整的基因組DNA，盡量不要多次進行物理性操作，如用加樣器反復吹打等，有時需要將加樣器頭尖剪斷，以防由于太細造成基因組DNA通過狹小通道而斷裂,注意事項：雙蒸水溶解沉淀要充分,加入15 l 雙蒸水, 溶解沉淀，-20保存,6、10,000 r/min 離心 5 min，棄上清(倒)。 10,000 r/min 離心 1 min，棄上清(吸)。 7、用濾紙條吸干管內(nèi)壁液體(不要觸及DNA沉淀)，室溫干燥10 min， 觀察DNA沉淀的顏色,10 l： 電泳 （下次課進行,余 5 l ：PCR模板（下次課進行,實驗第三部分、 DNA質(zhì)量檢

16、測 瓊脂糖電泳,DNA干燥、乙醇沉淀期間介紹,一、 原理,DNA分子在 pH 8.0 的電泳環(huán)境中，帶負電荷，在一定強度電場力的作用下，從負極向正極遷移。 電泳樣品載體瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，煮沸冷卻后形成網(wǎng)格樣結(jié)構，電泳中起分子篩作用。通常情況下，分子量大的DNA電泳過程中由于受到的阻力較大，泳動速率較慢，反之，分子量較小的DNA片段跑在前面,1% 瓊脂糖凝膠電泳。 在樣品中加 23ul 6上樣液，混勻， 加入上樣孔內(nèi) 電泳條件： 100110伏，30-40分鐘。 電泳結(jié)束后照像保存，結(jié)果分析,二、 操作,三、 常用試劑,上樣液成份： 10.25%溴酚藍或/和0.25%二甲苯青（樣品指示

17、劑） 240%蔗糖 或 30% 甘油（增加樣品比重），利于加樣。 電泳緩沖液： TAE 為例 T: Tris堿 A: 冰醋酸 E: EDTA 提供有一定緩沖能力的pH值(8.0), EDTA可抑制DNase 的作用。 溴化乙錠（EB）：染色劑 一種熒光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA 的堿基之間。在紫外光激發(fā)下能發(fā)出紅色的熒光,致癌劑,線性DNA片斷大?。╧b） 瓊脂糖濃度（%） 5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0,凝膠的濃度不合適時電泳會出現(xiàn)什么現(xiàn)象,四、 瓊脂糖凝膠的濃度,五、 電泳儀的使用方法,穩(wěn)壓: 電流旋鈕調(diào)到最大，再根據(jù)需要調(diào)節(jié)電壓。 如箭頭所示,六、預期