布病診斷標(biāo)準(zhǔn)

1、布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則1 主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了人群布魯氏菌?。?簡(jiǎn)稱布病 ）的診斷和疫區(qū)處理原則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類醫(yī)療、衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)。2 術(shù)語皮膚過敏試驗(yàn)： 受布氏菌感染后，再受到布氏菌過敏原刺激，皮膚出現(xiàn)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。布病疫區(qū)： 凡有新病人發(fā)生，或有疫畜檢出的自然村（ 屯）或畜牧場(chǎng) （隊(duì)） 均視為布病疫區(qū)。檢疫：用特異性的血清學(xué)，皮膚試驗(yàn)，分離細(xì)菌等方法對(duì)人畜布病的檢查。淘汰：對(duì)查出的陽性畜進(jìn)行屠宰處理。3 布病診斷 布病是一種嚴(yán)重地危害人民健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患的傳染病，染疫的家畜 是人和畜間布病的主要傳染源。3.1 流行病學(xué)：發(fā)病前病人與家畜或畜產(chǎn)品，布氏菌培養(yǎng)物

2、有密切接觸史，或生 活在疫區(qū)的居民，或與菌苗生產(chǎn)、使用和研究有密切關(guān)系者。3.2 臨床表現(xiàn)： 出現(xiàn)持續(xù)數(shù)日乃至數(shù)周發(fā)熱 （包括低熱 ），多汗， 肌肉和關(guān)節(jié)酸疼， 乏力，兼或肝、脾、淋巴結(jié)和睪丸腫大等可疑癥狀及體征。3.3 實(shí)驗(yàn)室檢查：布病玻片或虎紅平板凝集反應(yīng)陽性或可疑，或皮膚過敏試驗(yàn)后24、48h分別觀察1次，皮膚紅腫浸潤(rùn)范圍有一次在2.0cm x 2.0cm及以上（或4.0cm（上標(biāo)始 ）2（ 上標(biāo)終 ）以上 ）。3.4 分離細(xì)菌：從病人血液、骨髓、其他體液及排泄物中分離到布氏菌。3.5血清學(xué)檢查：標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)（SAT）滴度為1 : 100及以上；對(duì)半年內(nèi)有布氏菌苗接種史者，SAT滴度

3、雖達(dá)1 : 100及以上，過24周后應(yīng)再檢查，滴度升高4倍及以上；或用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）檢查，CFT滴度1 : 10及以上；抗人免疫球蛋白實(shí)驗(yàn)（Coomb / s）滴度1 : 400及以上。疑似病例：具備 3.1 、 3.2 和 3.3 者。確診病例：疑似病例加 3.4 或 3.5 中任何一種方法陽性者。4 疫區(qū)處理原則4.1 核實(shí)診斷：對(duì)確診的病人應(yīng)依據(jù)流行病學(xué)資料，臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 進(jìn)行核實(shí)診斷。4.2 檢疫和淘汰處理疫畜：對(duì)疫區(qū)內(nèi)全部羊，牛和豬用血清學(xué)方法進(jìn)行檢疫，檢疫后 1 個(gè)月再檢一次。凡檢出的陽性家畜均應(yīng)立即屠宰（或隔離飼養(yǎng) ）。至少在一年內(nèi)停止向外調(diào)運(yùn)牛、羊、豬。畜產(chǎn)

4、品均應(yīng)在原地存放和消毒，暫不外運(yùn)。4.3 消毒：被病畜的流產(chǎn)物污染的場(chǎng)地、用具、圈舍及尚未食用的奶制品均應(yīng)進(jìn) 行消毒處理。4.4 免疫：經(jīng)兩次檢疫呈陰性反應(yīng)的家畜，以及疫區(qū)周圍村受威害的畜群，應(yīng)連 續(xù) 3 年以畜用菌苗進(jìn)行免疫，每年免疫覆蓋率不應(yīng)低于 90 。4.5 臨床監(jiān)測(cè)及治療：對(duì)疫區(qū)內(nèi)接觸家畜及畜產(chǎn)品的人員進(jìn)行血清學(xué)及皮膚過敏 試驗(yàn)，查明人群感染情況，凡確診的病人均應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)治療。4.6 宣傳教育：對(duì)疫區(qū)的居民及職業(yè)人群進(jìn)行布病的危害、臨床表現(xiàn)及防治知識(shí) 的宣傳教育。4.7 疫區(qū)處理效果驗(yàn)證：在疫區(qū)處理后的第二年始，連續(xù)三年對(duì)疫區(qū)及疫區(qū)周圍 地區(qū)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證方法按照農(nóng)業(yè)部和衛(wèi)生部共同制

5、定的布病疫區(qū)控制考核標(biāo)準(zhǔn) 的要求進(jìn)行。附錄 A布魯氏菌病診斷的特異性實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)（ 補(bǔ)充件 ）A1 從可疑布病患者分離布魯氏菌A1.1 血培養(yǎng)A1.1.1雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)：無菌從可疑病人靜脈取血液45mL,在酒精燈火焰附近將血液注入 56支含雙相培養(yǎng)基的中試管內(nèi)，或24只含雙相培基燒瓶中，輕輕混合傾斜，使被檢血液分布在瓊脂斜面上，置37 C溫箱培養(yǎng)，如果懷疑病人是牛種布魯氏菌感染時(shí)，應(yīng)有一半標(biāo)本置 C0（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）環(huán)境中培養(yǎng)，三天后觀察結(jié)果， 如未見布氏菌生長(zhǎng)，可按上法再傾斜，使血液涂在瓊脂斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔一天 觀察一次， 如有可疑布魯氏菌落， 可用鉑金耳勾出接種到瓊脂試管培基

6、， 獲得純培養(yǎng)， 進(jìn)一步作布氏菌鑒定，血培養(yǎng)二十天仍不出菌，可定為陰性。A1.1.2 接種未受精雞卵法：取新鮮雞蛋兩個(gè)，把雞蛋放在固定架上，銳端向上， 以碘酒和酒精依次消毒蛋殼，用眼科手術(shù)刀在頂部穿一小孔，用三厘米長(zhǎng)注射針頭將 被檢血液徐徐注入卵黃中，每個(gè)雞蛋接種血液 0.2mL ，立即用滅菌石蠟將孔密封，置 37 C溫箱中培養(yǎng)，五天后把接種血液的雞蛋無菌打開，用滅菌的毛細(xì)管把接種血液部 分的卵黃及蛋清吸出0.50.6mL，接種23支斜面培養(yǎng)基上，置 37 C培養(yǎng)，23天觀察一次， 15 天仍不見可疑菌落生長(zhǎng)，定為陰性。A1.2 骨髓培養(yǎng) 用滅菌的導(dǎo)尿管將尿液導(dǎo)出放入滅菌容器中，為濃縮細(xì)菌，提

7、高檢出率，可在尿 液中加入1 %3%的高價(jià)布魯氏菌免疫血清，混合后，置37 C溫箱2h，高速離心沉淀，取沉淀物 0.5mL 接種在選擇性培基上培養(yǎng)，或注射豚鼠，用生物學(xué)法分離布魯氏 菌。A1.3 其他病原材料培養(yǎng) 由乳，腦脊液，關(guān)節(jié)液和滑囊液分離布魯氏菌，將液體標(biāo)本無菌地接種到瓊脂斜 面上，或培養(yǎng)平板上，涂布于培基表面，參照血培養(yǎng)法觀察結(jié)果，15 天仍無可疑菌生長(zhǎng)，定為陰性。A1.4 生物學(xué)分離布魯氏菌法 為了提高對(duì)布魯氏菌的檢出率和從污染的材料中分離布魯氏菌，將被檢材料 （固體標(biāo)本加滅菌的生理鹽水研碾成漿液態(tài) ）經(jīng)皮下或腹腔注射豚鼠或小白鼠，豚鼠接種 1m L ，小鼠接種 0.5mL ，接種

8、豚鼠，即可觀察血清變態(tài)反應(yīng)情況，又可作細(xì)菌分離培養(yǎng)， 小鼠感染后二十天解剖取臟器培養(yǎng)，豚鼠接種后三十天解剖取臟器培養(yǎng)。A2 特異性血清學(xué)檢查A2.1 平板凝集試驗(yàn) （PAT）A2.1.1 器材及試劑 赫德遜氏凹玻板或一塊清潔無油脂玻璃板，平板凝集抗原，被檢血清，已知陰性 和陽性血清， 0.1mL 吸管或微量加樣器，牙簽或細(xì)鐵絲。A2.1.2 操作方法備方形潔凈的玻璃板，劃成25 個(gè)方格 （ 或更多 ），橫數(shù) 5 格，縱數(shù) 5 格，第一列各格寫下血清號(hào)碼。用 0.1mL 吸管按下列劑量加受檢血清于任何一行（橫格 ） 的各格中：第一格 0.08mL ，第二格 0.04mL ，第三格 0.02mL

9、，第四格 0.01mL 。加平板凝集抗原 0.03mL 于各血清格中，用牙簽或細(xì)鐵絲混合，由血清量最小的 格混起，每份血清用一根牙簽混合即可，用后燒毀，若用細(xì)鐵絲混合時(shí)，每份血清混 合后用酒精棉球擦凈，然后再用作另一份血清?；靹蚝髮⒉ＡО逯糜诰凭珶艋鹧婊蚰磻?yīng)箱上，均勻加溫，使其達(dá)到30 C左右，5min 內(nèi)記錄反應(yīng)結(jié)果。每次試驗(yàn)用陰、陽性血清各 1 份作對(duì)照。 按下列標(biāo)準(zhǔn)用加號(hào)記錄反應(yīng)強(qiáng)度： ：出現(xiàn)大的凝集片或小的粒狀物，液體完全透明，100 凝集。：有明顯的凝集片，液體幾乎完全透明，75 凝集。：有可見的凝集片，液體不甚透明， 50凝集。：液體混濁，只有少量粒狀物， 25 凝集。 ：液體

10、均勻混濁。平板凝集反應(yīng)與試管凝集反應(yīng)的關(guān)系：0.08mL血清量出現(xiàn)凝集相當(dāng)于試管法1 : 25的血清稀釋度，0.04mL相當(dāng)于1 :50, 0.02mL 相當(dāng)于 1 : 100，O.OImL 相當(dāng)于 1 : 200。 A2.1.3 判定人血清 0.02mL 出現(xiàn)及以上凝集程度判為陽性，人血清 0.04mL 出現(xiàn)及 以上凝集程度判為可疑。A2.2 虎紅平板凝集試驗(yàn) （RBPT）A2.2.1 器材及試劑清潔脫脂玻片或有凹型孔的玻片， 0.1mL 吸管或微量加樣器，牙簽或細(xì)鐵絲，虎 紅平板凝集抗原，被檢血清。A2.2.2 操作方法在玻片上加 0.03mL 被檢血清， 然后加入虎紅平板抗原 0.03m

11、L ，搖勻或用牙簽混 勻，在 5min 內(nèi)判定結(jié)果。A2.2.3 判定判定凝集程度 （至 ）同平板凝集反應(yīng)亦可只分為（ ）陽性， （）陰性兩類。A2.3 試管凝集試驗(yàn) （SAT）A2.3.1 器材及試劑試管凝集抗原，被檢血清， 0.5 的石碳酸生理鹽水，吸管，凝集試管，溫箱和試 管架等。A2.3.2 操作方法被檢血清的稀釋：在一般情況下，每份血清用5支小試管（口徑810mm），第一管加入 2.3mL 石碳酸生理鹽水，第二試管不加，第三、四、五管各加 0.5mL ，用 1m L 吸管吸取被檢血清 0.2mL ，加入第一管中，混勻?；靹蚝螅栽撐芪〉谝还苤?血清加入第二管和第三管各0.5mL

12、，以該吸管將第三管混勻，并吸取 0.5mL 加入第四管，混勻。再?gòu)牡谒墓芪?.5mL ，棄去。如此稀釋后，從第二管到第五管血清稀釋度分別為 1 : 12.5 , 1 : 25, 1 : 50 和 1 : 100。加入抗原：先以0.5 %石碳酸生理鹽水將抗原原液作適當(dāng)稀釋（一般是作1 : 10稀釋）。稀釋后的抗原加入各稀釋的血清管 （第一管不加， 作為血清對(duì)照 ），每管加 0.5mL ， 混勻。加入抗原后，每管總量 1mL ，血清稀釋度從第二管至第五管分別為 1: 25， 1: 50， 1: 100 和 1: 200，從第一管再吸出 0.5mL ，剩 1mL。對(duì)照： 陰性血清對(duì)照， 血清稀釋后

13、加抗原 （與被檢血清對(duì)照相似 ）。陽性血清對(duì)照， 其血清稀釋到原有滴度，再加抗原，抗原對(duì)照，適當(dāng)稀釋的抗原加石碳酸鹽水。A2.3.3 判定 判定比濁管制備：每次試驗(yàn)須配制比濁管作為判定的依據(jù)。配制方法是：取本次 試驗(yàn)用的抗原稀釋液 510mL ，加入等量的 0.5 %碳酸鹽水作倍比稀釋，按表 A1 配 制比濁管。表 A1 比濁管配制全部試驗(yàn)管，對(duì)照管及比濁管充分振蕩后置37 C溫箱中2022h，取出后放室溫2 h ，然后以比濁管為標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。記錄結(jié)果：根據(jù)各管中上層液體的清亮度記錄結(jié)果。特別是50%清亮度 （ ）對(duì)判定結(jié)果關(guān)系較大，一定要與比濁管對(duì)比判定。：完全凝集，上層液 100 %清亮。

14、：幾乎完全凝集，上層液 75 % 清亮。：顯著凝集，液體 50%清亮。：有微量凝集，液體 25%清亮。：無 凝集，液體不清亮。確定每份血清滴度是以出現(xiàn)十十及以上的凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度。A2.4 抗人免疫球蛋白試驗(yàn) （COOMBS）A2.4.1 器材及試劑除試管凝集試驗(yàn)所需的一般器材及試劑外，還需抗人免疫球蛋白血清及普通離心 機(jī)。A2.4.2 操作方法試管凝集試驗(yàn)階段：按 A2.3 進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)?？姑庖咔虻鞍椎姆磻?yīng)階段：選取試管凝集試驗(yàn)的可疑反應(yīng)管及全部陰性反應(yīng)管， 記錄管號(hào)，經(jīng) 4000r/min 離心 15min ，用生理鹽水反復(fù)洗滌三次，然后向各管中加入 生理鹽水 0.5mL 、一

15、定稀釋度 （一般是 1 : 20 倍稀釋 ）的抗人免疫球蛋白血清，混勻， 將反應(yīng)管置37C溫箱中2022h，取出放室溫2h后判定結(jié)果。判定：判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，程度均同試管凝集試驗(yàn)。A2.5 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) （CFT）A2.5.1 器材及試劑37 C水浴箱，普通離心機(jī)，普通冰箱，各種容量的吸管，燒瓶，凝集管和試管架， 生理鹽水，補(bǔ)體 （新鮮豚鼠血清，或凍干補(bǔ)體 ）， 2的綿羊紅細(xì)胞懸液，溶血素，補(bǔ)體 結(jié)合抗原，陰性和陽性血清，被檢血清。A2.5.2 操作方法補(bǔ)體滴度：在進(jìn)行 CFT時(shí)，必須當(dāng)天滴定補(bǔ)體，將補(bǔ)體用生理鹽水稀釋為1 : 20，通常在十支凝集管中分別依次加入不同量的1 : 20稀釋補(bǔ)體0.

16、020.2mL，然后各管中加入2個(gè)單位的抗原液 0.2mL，再用生理鹽水把各管補(bǔ)至0.6mL，混勻后放37C水浴中30min，再加0.2mL的溶血素（2個(gè)單位）和2%紅細(xì)胞0.2mL，混勻，置3 7C水浴中30min，判定結(jié)果（見表A2）。表 A2 補(bǔ)體滴度程序和結(jié)果 mL上例中產(chǎn)生完全溶血且合補(bǔ)體量最少管為第八管，定為一個(gè)恰定單位，前一管 （即第七管）為一個(gè)完全單位。在正式試驗(yàn)時(shí)采用兩個(gè)完全單位的補(bǔ)體量，按式（A1）計(jì)算出補(bǔ)體稀釋倍數(shù) X 。20 : 2Y = X : 0.2 （A1）式中： Y1 個(gè)完全單位補(bǔ)體量。溶血素及抗原滴定： 在進(jìn)行 CFT 時(shí)溶血素和抗原亦需滴定， 但不必在試驗(yàn)當(dāng)

17、天進(jìn) 行；而且，在購(gòu)到此二試劑時(shí)出售單位（或提供單位 ）都已滴定了，需用單位按說明稀釋即可。被檢血清滅活：人血清滅活補(bǔ)體的溫度是56 C，時(shí)間為30mi n。本試驗(yàn)：滅活后的被檢血清從 1: 5稀釋開始，然后作倍比稀釋，每管中稀釋血 清量為0.2mL，再向各管中加 2個(gè)單位抗原0.2mL , 2個(gè)單位補(bǔ)體量0.2mL，混勻， 置37 C水浴中30min，取出后，向各管加 0.4mL的溶血素，再放 37 C水浴中作用 3 0min ，判定結(jié)果 （見表 A3）。表 A3 CFT 本試驗(yàn)程序 mLA2.5.3 判定：無溶血， SRBC 沉于管底或懸浮。:25%溶血。:50%溶血。: 75%溶血。：100%溶血。以 50 % （ ）及以上不溶血確定 CFT 的滴度。為防止判定的錯(cuò)誤，可配制標(biāo)準(zhǔn)溶血管（見表 A4）。表 A4 標(biāo)準(zhǔn)溶血管的配制 mLA3 皮膚過敏試驗(yàn)A3.1 器材及試劑布魯氏菌素， 75 %酒精棉球，結(jié)