第二節(jié)-聚合酶鏈式反應ppt課件

1、第二節(jié) 聚合酶鏈式反應Polymerase chain reactionPCR,Content of Table,一、PCR的定義 二、PCR技術的優(yōu)點 三、PCR原理 四、PCR的標準反應體系 五、PCR反應五要素 六、PCR類型及應用,一、PCR的定義,在引物指導下由酶催化的對特定克隆或基因組DNA序列進行的體外擴增反應,PCR技術的創(chuàng)建,Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。 1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。 1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

2、1989年美國Science雜志列PCR 為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎,Kary B. Mullis（1944,二、PCR技術的優(yōu)點,特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等 能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍,三、PCR原理,Sample 1. denaturatation 2. Primer annealing 3. Primer extension,Region to be copied,PCR技術原理,類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的

3、寡核苷酸引物。 模板DNA變性：加熱至94左右，雙鏈DNA解離成單鏈； 模板DNA與引物的退火(復性)：55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合； 引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的雙鏈； 重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，使DNA擴增量呈指數(shù)上升,PCR的基本反應步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,PCR的基本原理,重復13步 2530輪,目的DNA片段 擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈 與引物復性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反應條件

4、 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,第1輪結束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,第2輪結束,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴

5、增,PCR product,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,PCR儀,四、PCR的標準反應體系,10擴增

6、緩沖液 10l 4種dNTP混合物 各200mol/L 引物 10100 pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5 ul （Mg2+） 1.5 mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul,Home,五、PCR反應五要素,引物 （primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium,六、PCR的類型及應用,1、 PCR的類型 反轉錄PCR技術：RNA的反轉錄與PCR的聯(lián)合應用 原位PCR技術：在細胞內進行，不需要提取DNA 實時PCR技術：進行DNA的定量

7、分析 筑巢PCR 彩色PCR 多重PCR 不對稱PCR 共享引物PCR 差異顯示PCR 錨定PCR 重組PCR,2、 PCR的應用,研究 -基因克隆、測序、分析突變 診斷 -細菌、病毒、寄生蟲檢測、診斷 人類基因組工程 -遺傳圖譜的構建、測序、表達圖譜 法醫(yī) -犯罪現(xiàn)場標本分析 腫瘤檢測 其他,法醫(yī)學,個人識別、親子鑒定 1985年，英國遺傳學家Jeffreys采用DNA 指紋圖譜進行個人識別和親子鑒定。 有時犯罪物證量很少，不足以用來進行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問題。對于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學上認證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術被普遍采用,什么是“DNA指紋技術”,世界上除同卵雙生外，幾乎沒有指紋一模一樣的兩個人，所以指紋可以用