中圖版選修1第6章第2節(jié)DNA片段的擴(kuò)增-PCR技術(shù)學(xué)案

1、第二節(jié)DNA片段的擴(kuò)增一一PCF技術(shù)iO自主學(xué)習(xí)基礎(chǔ)知識(shí)一、DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制1. 所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。2. 引物：一段RNA3原料：四種脫氧核苷酸。4原則：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。二、PCF技術(shù)的過程1. 把PCF緩沖液、DNA莫板、一對(duì)引物、四種脫氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg*等成分加 入到微量離心管中。2. 把離心管置于95C的高溫中，使 DNA堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，DNA雙鏈拆開成為兩條單鏈。3. 將離心管置于55C的環(huán)境中，使一對(duì)引物分別結(jié)合到兩條分開的模板鏈上。4再將離心管轉(zhuǎn)置于 72C的環(huán)境中，在 DNA聚合酶的催化下，游離的脫氧核苷酸從弓I 物的一端進(jìn)行

2、順次連接，從而形成兩條新的子鏈。這樣高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸三個(gè) 步驟便構(gòu)成了 PCR過程的一個(gè)循環(huán)。三、實(shí)驗(yàn)操作1. 準(zhǔn)備為了避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的離心管、吸頭、緩沖液以及蒸 餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。(2)如果沒有PCF儀，可以設(shè)置3個(gè)恒溫水浴鍋，溫度分別為 95C、55C和72C，然后 按要求在3個(gè)水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移 PCR的微量離心管即可。2. 擴(kuò)增3. 檢測(cè)利用DNA在 260nm的紫外線波段的吸收值曲線來測(cè)定相應(yīng)含量。即: DNA的濃度(卩g/mL)預(yù)習(xí)完成后，請(qǐng)把你認(rèn)為難以解決的問題記錄在下面的表格中問題1中華.資*源%庫(kù)ziyua nk u.co

3、m問題2問題3問題4合作探究重難疑點(diǎn)步步採(cǎi)究吸收內(nèi)化ZHONGNANTUPO突破-DNA復(fù)制（體內(nèi)）與PCF技術(shù)（體外）體內(nèi)復(fù)制PCR反 應(yīng)不同點(diǎn)中/華-資*源%庫(kù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能 量，部分解開加熱至95 C左右，雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合 成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度72 C特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增TaqDNA聚 合酶不需要需循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次溫度體內(nèi)溫和條件咼溫（可變）相同點(diǎn) 需提供DNA復(fù)制的模板 四種脫氧核苷酸為原料 都需要一定的緩沖溶

4、液 子鏈延伸的方向都是從 5端到3端解旋酶的作用是使 DNA兩條鏈的氫鍵斷開，而DNA聚合酶與DNA連接酶都是催化形成 磷酸二酯鍵。DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的3端上，需要模板，而DNA連接酶連接的是兩條 DNA片段的缺口，不需要模板。二、PCF技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作程序 1. PCRT增前的準(zhǔn)備高壓滅菌移液每次更換吸頭準(zhǔn)備三個(gè)水浴鍋2. PCRT增循環(huán)預(yù)變性時(shí)間延長(zhǎng)最后一次延伸時(shí)間延長(zhǎng) 3. 檢測(cè)PCRT增效果稀釋DNA含 量4.繪圖(DNA的紫外線吸收曲線圖)卜例PCR技術(shù)的原理及過程DIANLiTANJiU探究如圖為某一次循環(huán)的產(chǎn)物，請(qǐng) 據(jù)圖回答問題。(1) PCR 般要經(jīng)歷三

5、十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為、三個(gè)步驟。一(2) PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi) DNA復(fù)制在解旋時(shí)原理不同：細(xì)胞內(nèi)復(fù)制利用 使雙鏈間氫鍵斷裂，而PCR技術(shù)利用 原理，使雙鏈氫鍵斷裂。以引物為標(biāo)識(shí)，可判斷出此產(chǎn)物最早為第次循環(huán)的產(chǎn)物。(3) PCR反應(yīng)中，如果以引物為標(biāo)識(shí)，共有幾種DNA分子產(chǎn)生？你能把它們畫出來嗎?【審題導(dǎo)析】【精講精析】(1)PCR的每一輪循環(huán)包括高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸三步，從第二輪循環(huán)開始，每次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)。(2)DNA分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)。在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂，而在體外，DNA在 95 C的高溫中變性。即雙螺旋解開，成為單鏈；當(dāng)溫度慢慢降低后，兩條彼此分離的

6、單鏈又會(huì)重 新結(jié)合形成雙鏈。在 PCR反應(yīng)中，以引物為標(biāo)記，第一次循環(huán)時(shí)，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物I和引物H與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每個(gè)子DNA中只有一種引物；從第二次循環(huán)開始，上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng)，所以會(huì)出現(xiàn)DNA分子兩端均含引物的情況，如圖所示：引物U丨I I丨丨丨丨I I IT I I丨引物【因此題干中所出現(xiàn)的情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。(3)產(chǎn)生的DNA分子有3種：只含引物I的，只含引物n的和既含引物I也含引物n的。【答案】(1)高溫變性低溫復(fù)性中溫延伸(2) 解旋酶熱變性 一(3) 共有3種，分別為：I LI I I I

7、I I I I I I I I LI I引物1引物U引物n引物I當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度由變性后快速冷卻到50 C左右時(shí)，引物與模板結(jié)合，一般不考慮解開的兩個(gè)DNA模板鏈的重新結(jié)合，原因：a.模板DNA比引物長(zhǎng)得多而且復(fù)雜的多，不易 重新結(jié)合；b.引物與模板間的碰撞機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于模板互補(bǔ)鏈間的碰撞；c.加入的引物量足夠大而模板鏈數(shù)量少。kMitillLISPCR技術(shù)是把DNA片段在體外酶的作用下，合成許許多多相同片段的一種方法，禾U用它 能快速而特異地?cái)U(kuò)增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本過程如圖所示：島視變性中.岳0覽二95(45-55注：圖中短線表示每次擴(kuò)增過程中需要的引物。每個(gè)引物

8、約含2030個(gè)脫氧核苷酸，并分別與兩條單鏈 DNA吉合，其作用是引導(dǎo)合成DNA子鏈。(1) PCR技術(shù)的原理是模擬生物體內(nèi) 的過程。(2) PCR擴(kuò)增過程中需要對(duì) DNA片段進(jìn)行高溫處理，其目的是 ，此過程在生物體內(nèi)稱為，需酶的參與。(3) 假如引物都用3H標(biāo)記，從理論上計(jì)算，所得DNA分子中含有3H標(biāo)記的占 。(4) 假定DNA片段含200對(duì)脫氧核苷酸，經(jīng) 3次擴(kuò)增，從理論上計(jì)算需要 個(gè)游離脫氧核苷酸?！窘馕觥?1)(2)由圖可知高溫變性的過程就是DNA在高溫條件下解旋的過程， 在生物體內(nèi)則需要酶的催化才能進(jìn)行。低溫復(fù)性時(shí)兩條DNA分子都需要引物；(3)每次低溫復(fù)性時(shí)，3引物都與兩條單鏈 D

9、NA吉合，進(jìn)而形成雙鏈 DNA所以所得DNA中均含H。擴(kuò)增3次一共形 成了 8個(gè)子代DNA片段，需游離的脫氧核苷酸數(shù)為(8 1) X 400= 2 800個(gè)?！敬鸢浮?1)DNA復(fù)制(2) 使DNA兩條鏈彼此分開解旋 解旋(3) 100%(4)2 800當(dāng)堂落實(shí)*雙基達(dá)標(biāo)1. PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是()A. 原理簡(jiǎn)單B. 原料易找C. 所用DNA聚合酶具有耐熱性D. 快速、高效、靈活、易于操作【解析】PCR技術(shù)實(shí)際上是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制過程，形成大量特異性的 DNA 片段。原理復(fù)雜、原料多樣，但操作卻十分簡(jiǎn)單。快速、高效、靈活和易于操作正是PCR技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)。【答案】D2.下列

10、哪種溫度下 DNA會(huì)發(fā)生復(fù)性()A. 95 CB. 55 CD.C. 37.5 C【解析】DNA解旋在95 C環(huán)境下，復(fù)性溫度為 55 C,在72 C時(shí)，DNA鏈得以延伸。【答案】 B3. TaqDNA聚合酶由水棲高溫菌分離而得。其生長(zhǎng)適宜溫度為70 C75 C?；卮鹣铝袉栴}：(1) 用TaqDNA聚合酶代替一般的 DNA聚合酶是使PCF普及應(yīng)用的關(guān)鍵。因?yàn)槠胀ǖ拿覆荒苣褪?4 C時(shí)使雙鏈DNA變性的溫度。因此，每次循環(huán)都要 , TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用解決了上述問題，提高了 PCR的效率，使PCF技術(shù)趨向。(2) PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA片段時(shí)，決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短。(3) 若加入的模板是兩個(gè)相同的 DNA分子，如果只想要“拷貝”這兩個(gè)長(zhǎng)長(zhǎng)的 DNA分子中“特定區(qū)間”，在其他條件均理想時(shí)，經(jīng)過三十次循環(huán)，理論上能獲得個(gè)“特定區(qū)間”片段。【解析】普通DNA聚合酶在DNA變性溫度條件下失活，因此，必須循環(huán)一次更換一次新酶才能保證DNA復(fù)制順利進(jìn)行，而 TaqDNA聚合酶在94 C的DNA變性條件下不會(huì)失活，故 可以反復(fù)利用，解決了 PCR聚合酶只能從兩引物的 3端開始連接脫氧核苷酸，是DNA片段延伸的起始位點(diǎn)，兩引物的