菌種傳代與復(fù)蘇

1、4.1 菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種、微生物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種傳代與保藏是一項重要的基礎(chǔ)工作。4.2 菌種代號 國內(nèi)藥品微生物檢驗所用的菌種代號是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC-中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心， 、，B代表細(xì)菌，F(xiàn)代表真菌。 金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003大腸桿菌CMCC(B)44102 枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 4.3 傳代和接種

2、 4.3.1 菌種凍干粉復(fù)蘇 4.3.1.1把凍干菌種管、滅菌1ml滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化臺。4.3.1.2 先用砂輪將凍干菌種安瓿瓶頸部挫出挫痕，再將凍干菌種管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，是驟冷而炸裂。4.3.1.3取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，領(lǐng)取一只滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉

3、湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面進(jìn)行培養(yǎng)。4.3.2菌種斜面?zhèn)鞔僮?.3.2.1 培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌種名及菌種編號。至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。4.3.2.2點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手無名指，小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)深入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種環(huán)，

4、并將菌種管口移至火焰旁。4.3.2.3堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面一支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)深入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。4.3.2.4取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。4.4菌種的培養(yǎng)與保存 4.4.1 大腸桿菌35-37攝氏度培養(yǎng)48小時 金黃色葡萄球菌30-35攝氏度培養(yǎng)48小時 枯草芽孢桿菌30-35攝氏度培養(yǎng)48小時 白色念珠菌23-28攝氏度培養(yǎng)7天 黑曲霉23-28攝氏度培養(yǎng)7天 4.4.2 將培養(yǎng)物管自培養(yǎng)箱取出后放入冰箱（2-8攝氏度）保存，一般

5、2個月轉(zhuǎn)種一次。 4.5 菌懸液的制備 4.5.1 取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營養(yǎng)肉湯中（10ml/支，已滅菌），將已接種畢的細(xì)菌管置35-37攝氏度培養(yǎng)18-24小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用兩周。 4.5.2 取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只刻度吸管吸取10-1菌液1ml加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中混勻，為10-2.以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在50-100個。用平板計數(shù)。4.5.3 此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在一周內(nèi)使用。4.7 記錄 4.7

6、.1 傳代和接種使用后，應(yīng)做好菌種傳代接種記錄。4.7.2 菌懸液制備后，應(yīng)做好菌液制備使用記錄。依據(jù): 中國藥典2015年版二部及菌種使用說明書1.標(biāo)準(zhǔn)菌的來源標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷凍干燥菌種（0代）或由上級藥檢部門已接種好的菌種斜面（3代）。黑曲霉的0代菌種為保存于含15%甘油的0.9%無菌氯化鈉溶液中的孢子懸液冷存管。中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌種的標(biāo)簽CMCC（B）代表細(xì)菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每種菌具

7、有固定的代號。2.標(biāo)準(zhǔn)菌的驗收從菌種保藏中心購買的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干菌，接收同時應(yīng)檢查是否有隨菌種附有的相關(guān)資料。接收菌種時應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和名稱，和每一支安瓿的完整性。在相應(yīng)的菌種接收記錄上記上所有的關(guān)于菌種的信息，如名稱、數(shù)量和接收日期等。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標(biāo)簽，內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號、代次、接收日期、接收人、貯存條件、有效期至。新購入的0代原始菌種儲存于20，有效期為三年。從上級藥檢部門購買的已接種好的菌種斜面（3代）應(yīng)檢查菌種管是否完好。儲存于28 ，有效期為3個月。3. 標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇、復(fù)壯及標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株的制備3.1物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及

8、75%酒精棉球3.2培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基:用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯.液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基:用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯。改良馬丁培養(yǎng)基:用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯.3.3操作步驟：a.打開潔凈工作臺。b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）。d.以無菌方法用一無菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml到安瓿中。e.輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混

9、合并完全溶解。f.用無菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。g.根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)1824小時；真菌培養(yǎng)溫度2328，培養(yǎng)35天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種復(fù)蘇生長；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至7天，真菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內(nèi)液體12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置2328培養(yǎng)57天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色，斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無菌氯化

10、鈉溶液洗脫到無菌試管中。i.取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液8-10ml至液體培養(yǎng)基中按g項操作對菌種進(jìn)行復(fù)壯。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，1-2ml/管分裝于凍存管。每個菌種制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲備管。黑曲霉的h項下洗脫液按h項下方法進(jìn)行復(fù)壯，制成復(fù)壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入20ml 、30%的無菌甘油混勻，1-2ml/管封存于凍存管。制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標(biāo)簽。內(nèi)容包括：菌

11、種名稱、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。j儲備菌種管制備成功，儲存于20，有效期為三年。3.4菌種確認(rèn)用無菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，或相應(yīng)的宜于該細(xì)菌生長的鑒別平板上，劃線分離出單個菌落。然后在3035下培養(yǎng)23天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，并在2328下培養(yǎng)7天；培養(yǎng)后，觀察其菌落形態(tài)，應(yīng)符合該菌種形態(tài)特征。3.5污染處理假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長，則說明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理?？蓪ふ以蛑匦路蛛x挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲備菌種管3.6菌種的傳代與保藏將菌種接

12、種至一新鮮培養(yǎng)基上，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當(dāng)原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長，即認(rèn)為已傳代一次，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種后為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代。菌種的傳代保藏過程 3.3項下標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇為傳第一代，復(fù)壯為第二代。 傳第三代時取1支凍存管自然解凍，將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代(W3)，一類用于實驗用（S3）。定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30分鐘。（

13、2）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺，打開紫外燈照射一小時。（3）關(guān)閉紫外燈。點燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過三次。（4）右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底

14、部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。（6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。（7）將已接種好的細(xì)菌管置3035細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 24h，真菌管置2328真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng)7天。當(dāng)工作用菌種傳代代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉(zhuǎn)接為（W4）。按上述程序操作，直至（W4）轉(zhuǎn)為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進(jìn)行銷毀。菌種培養(yǎng)條件及時間培養(yǎng)基保存條件及時間大腸埃希菌(CMCC(B)44102)30352224h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月金

15、黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)30352224h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)30352224h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)30352224h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50094)30352224h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月生孢梭菌(CMCC(B)64941)30352224h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月白色念珠菌(CMCC(F)98001)2328 最多7天改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月黑曲霉(CMCC(F)98003)2328 最多7天改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基28 保存3個月