光譜分析法劉蕓

1、儀器分析方法分類,2. 電化學分析法: 依據(jù)物質(zhì)的電化學性質(zhì)及其變化,4. 質(zhì)譜法、熱分析法、放射化學法等,1. 光學分析法: 基于電磁輻射與物質(zhì)的相互作用,3. 色譜法: 氣相色譜法、液相色譜法,1,第三章 光譜分析法,Spectrum Analysis,2,本章提要,第一節(jié) 光譜分析法概論,第二節(jié) 紫外/可見光吸收光譜法,光譜分析法及其特點 電磁輻射的基本性質(zhì) 電磁輻射的特性 光譜分析法的分類 分子光譜法,基本原理 紫外/可見分光光度計構(gòu)造 紫外/可見分光光度計類型,3,第三節(jié) 分子發(fā)光光譜法,光致發(fā)光 分子熒光和磷光光譜基本原理 影響熒光強度的因素 分子熒光光譜儀 分子熒光光譜法的應(yīng)用

2、磷光光譜法 化學發(fā)光法,4,本章提要,第一節(jié) 光譜分析法概論,5,是電磁輻 射按照波 長的有序 排列,光譜 (spectrum,第一節(jié) 光譜分析法概論,6,一、光譜分析法及其特點,光譜分析 (spectral analysis)： 對物質(zhì)發(fā)射輻射能的能譜分析或?qū)椛淠芘c物質(zhì)相互作用引起的能譜改變的分析。 電磁輻射范圍：射線（10-10m）無線電波（103m）所有范圍； 相互作用方式：發(fā)射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等； 應(yīng)用：光譜分析法在研究物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)表征、表面分析等方面具有其他方法不可區(qū)代的地位,7,1）能源提供能量； （2）能量與被測物之間的相互作用； （3）產(chǎn)生信號。 基本特

3、點： （1）所有光分析法均包含三個基本過程； （2）選擇性測量，不涉及混合物分離（不同于色譜分析）； （3）涉及大量光學元器件,三個基本過程,一、光譜分析法及其特點,8,二、電磁輻射的基本性質(zhì),電磁輻射（電磁波）：以接近光速（真空中為光速）傳播的能量； c = =/ E = h = h c / c：光速；：波長；：頻率；：波數(shù) ； E ：能量； h：普朗克常數(shù) 電磁輻射具有波動性和微粒性（波粒二象性,9,三、輻射能的特性,1) 吸收 物質(zhì)選擇性吸收特定頻率的輻射能，并從低能級躍遷到高能級； (2) 發(fā)射 將吸收的能量以光的形式釋放出； (3) 散射 由傳播介質(zhì)的不均勻性引起的光線向四周射去；

4、(4) 折射 折射是光在兩種介質(zhì)中的傳播速度不同； (5) 反射 光射到不同的介質(zhì)介面時，部分光自介面射回原介質(zhì)中； (6) 干涉 干涉現(xiàn)象； (7) 衍射 光繞過物體而彎曲地向他后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象； (8) 偏振 只在一個固定方向有振動的光,10,常用三種光分析法測量過程示意圖,11,四、光譜分析分類,光譜分析法,原 子 吸 收,紫 外 可 見,紅 外 可 見,核 磁 共 振,紫 外 可 見,紅 外 可 見,分 子 熒 光,分 子 磷 光,核 磁 共 振,化 學 發(fā) 光,原 子 發(fā) 射,原 子 熒 光,分 子 熒 光,分 子 磷 光,X 射 線 熒 光,化 學 發(fā) 光,12,五、分子光譜法,物質(zhì)

5、分子內(nèi)部運動形式及其對應(yīng)能級 1. 電子相對于原子核的運動-電子能級; 單重態(tài)：激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反. 三重態(tài)：激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同. 2. 原子核在其平衡位置附近的相對振動 -振動能級; 3. 分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動-轉(zhuǎn)動能級,13,分子的能級圖與躍遷,Sn: 電子能級,Vn: 振動能級,Jn: 轉(zhuǎn)動能級,分子的總能量 = E電子+ E振動+ E轉(zhuǎn)動,14,分子光譜分析法的分類,分子光譜,分子吸收,分子發(fā)光,光致發(fā)光,其它發(fā)光形式,UV-Vis （紫外-可見,IR（紅外,如：熒光和磷光,如：化學發(fā)光等,15,第二節(jié) 紫外/可見光吸收光譜法,16,紫外/可見光吸收光譜分

6、析法： 利用溶液中分子吸收紫外和可見光產(chǎn)生躍遷所記錄的吸收光譜圖，可進行化合物結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)最大吸收波長強度變化可進行定量分析。屬于分子吸收光譜法，分析波長范圍一般為200800nm,歷史悠久、應(yīng)用廣泛,分析化學 藥物分析 臨床檢驗等,第二節(jié) 紫外/可見光吸收光譜法,17,即光吸收基本定律,朗伯定律:(1760) A=lg(I0/It)=k1b 當入射光的、吸光物質(zhì)的c 一定時，溶液的吸光度A與液層厚度b成正比,比爾定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 當入射光的、液層厚度b 一定時，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比,一、基本原理,18,朗伯-比爾定律,意義: 當一束平行單色光通

7、過均勻、透明的吸光介質(zhì)時，其吸光度與吸光質(zhì)點的濃度和吸收層厚度的乘積成正比,A=lg(I0/It)=kbc,一、基本原理,19,透光率（透射比）T（Transmittance,A = lg(I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc,吸光度A （Absorbance,一、基本原理,20,吸光度A、透射比T 與濃度c 的關(guān)系,一、基本原理,21,k 吸光系數(shù) （Absorptivity,3） 當c的單位用g100mL-1表示時，用 表示, A bc， 叫做比吸光系數(shù),一、基本原理,22,吸光度與光程的關(guān)系 A = abc,一、基本原理,23,吸光度與濃度的關(guān)系 A = abc,一

8、、基本原理,24,吸光度與波長的關(guān)系 A = abc,一、基本原理,25,溶液濃度的測定,A b c,工作曲線法 (校準曲線,朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用,一、基本原理,26,朗伯-比爾定律的適用條件,1. 單色光 應(yīng)選用max處或肩峰處測定,3. 稀溶液 濃度增大，分子之間作用增強,2. 吸光質(zhì)點形式不變 離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系, 應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等,一、基本原理,27,吸光度的加和性與吸光度的測量,A = A1 + A2 + +An,用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑對光的吸收等,一、基本原理,28,二、紫外

9、/可見分光光度計主要部件,光源,單色器,吸收池,檢測系統(tǒng),分光光度計的基本組成,習慣上將工作波段在200nm800nm的分光光度計稱為紫外-可見分光光度計,優(yōu)點： 通過色散原件（棱鏡或光柵）得到一束近似的單色光。 波長可調(diào), 故選擇性好, 準確度高,29,光源（發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜,可見光區(qū)：鎢燈，鹵鎢燈(3202500nm) 紫外區(qū)： 氫燈 (180375nm) 氙燈、汞燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源,要求：有足夠的光強度，穩(wěn)定,二、紫外/可見分光光度計主要部件,30,31,單色器（將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置,二、紫外/可見分光光度計主要部件,32,光柵：（利用光通過光柵

10、時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光的裝置,在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm,優(yōu)點：波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便,二、紫外/可見分光光度計主要部件,33,檢流計（指示器）： 低檔儀器：刻度顯示 中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動掃描記錄,檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號。如：光電池，光電管，光電倍增管,吸收池（比色皿）：用于盛待測及參比溶液,二、紫外/可見分光光度計主要部件,34,1. 單光束分光光度計,可變波長單光束紫外-可見分光光度計示意圖,三、紫外/可見分光光度計的基本類型,35,2. 雙光束分光光度計,參比池,檢測器,濾光片或 單

11、色器,放大器,樣品池,光源 hv,光子檢測器,反光鏡,反光鏡,透明部分,扇形鏡 正面圖,扇形鏡,反光鏡,柵鏡,雙光束型可以消除光源強度變化的影響,可變波長雙光束紫外-可見分光光度計示意圖,36,第三節(jié) 分子發(fā)光光譜法,37,分子發(fā)光,光致發(fā)光,化學發(fā)光,生物發(fā)光,光致發(fā)光（Photoluminescence）: 物質(zhì)當受到光的照射吸收了某種波長的光后，會發(fā)射出波長相同或比吸收波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光,Photoluminescence,Molecular Luminescence,Chemiluminescence,Bioluminescence,38,1575年，西班牙醫(yī)生N.Mo

12、nardes發(fā)現(xiàn)。 1852年，George Stokes對熒光產(chǎn)生的機理作了解釋，并提出了“熒光”。 1867年，分子熒光首次用于分析測定。 1928年，Jette和West提出第一臺光電熒光計。 1952年，商品熒光分光光度計出現(xiàn),分子熒光技術(shù)的發(fā)展,39,The Discovery and Development of the Green Fluorescent Protein,（GFP ）綠色熒光蛋白,2008諾貝爾化學獎 Osamu Shimomura 1960s Martin Chalfie 1990s Roger Y. Tsiens, today,40,一、分子熒光（磷光）發(fā)生的

13、原理,41,物質(zhì)的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，電子由第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)的各個振動能級，以光的形式放出末態(tài)兩個能級的能量差額稱為熒光。 基于化合物的熒光測量而建立 起來的分析方法稱為分子熒光光 譜法,42,1. 分子的多重態(tài)：單線態(tài)、激發(fā)單線態(tài)、激發(fā)三線態(tài) 單線態(tài)(S0) 一個所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。 多數(shù)有機物分子的基態(tài)是單線態(tài)。 當基態(tài)一對電子的一個被激發(fā)到較高能級時， 激發(fā)單線態(tài)(S) 自旋方向不改變，分子仍處于單線態(tài)。 激發(fā)三線態(tài)(T) 有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài),分子的激發(fā)與失活,43,分子的多重態(tài),ET1 ES1 S0T ：禁阻躍遷，

14、進入的幾率小,M=2S+1,S:為電子自旋量子 數(shù)的代數(shù)和(0或1,電子激發(fā)態(tài)的多重度,44,無輻射躍遷 振動弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級中的較高振動能級轉(zhuǎn)至較低振動能級的過程，其效率較高。 內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的兩個電子能級間，電子由高能級回到低能級的分子內(nèi)過程。 系間竄越：同一電子能級激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。 外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)相互作用、能量轉(zhuǎn)換而使熒光 （或磷光）減弱甚至消失的過程。熒光強度的減弱或消失，稱為熒光熄滅（或猝滅,激發(fā)態(tài)分子的失活,45,輻射躍遷 熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。 由于

15、是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)kf為106109s-1 。 磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。 產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的改變，輻射速度遠小于熒光，壽命較長,激發(fā)態(tài)分子的失活,46,熒光與磷光的產(chǎn)生過程,47,圖熒光與磷光產(chǎn)生示意圖,激發(fā)單線態(tài),激發(fā)三線態(tài),48,熒光,S1 S0躍遷 波長短 幾率大 速度較大 壽命短，10-9 10 -7s,磷光,T1 S0躍遷 波長長 幾率小 速度較小 壽命長，為10-4 10s,熒光與磷光的比較,49,二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜 （吸收光譜與發(fā)射光譜,50,1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜 (excitation spe

16、ctrum) 固定測量波長（選最大熒光/發(fā)射波長），化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強度與照射光波長的關(guān)系曲線。 2.熒光光譜(或磷光光譜) （fluorescence spectrum） 固定激發(fā)光波長（選最大激發(fā)/吸收波長）， 化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。 3. 最大激發(fā)波長(ex)和最大熒光波長(em,激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜,51,室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜,52,激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系,53,鏡像規(guī)則的解釋,吸收光譜,熒光光譜,54,鏡像規(guī)則的解釋,基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似,55,三、影響熒光強度的因素,56,分子產(chǎn)生熒光必

17、須具備的條件,熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如kikf，不出現(xiàn)熒光發(fā)射,熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,1）具有合適的結(jié)構(gòu),57,某些化合物的熒光效率,58,化合物的結(jié)構(gòu)與熒光,具有共軛雙鍵體系的分子,59,a）萘： 熒光效率為0.29； 熒光波長為310 nm,b）蒽： 熒光效率為0.46； 熒光波長為400 nm,多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定。 ex = 386 nm em = 430 nm,3，4 - 苯并芘 強致癌物,60,具有剛性不飽和平面結(jié)構(gòu)的分子,化合物的結(jié)構(gòu)與熒光,例,61,反式：平面構(gòu)型 強熒光體,順式：非平面構(gòu)型 非熒光體,例 1，2 - 二苯

18、乙烯,62,例 金屬螯合物,滂鉻BBR本身不發(fā)熒光,Al3+滂鉻BBR發(fā)紅色熒光,63,苯環(huán)上取代基的類型,化合物的結(jié)構(gòu)與熒光,給電子基團常使熒光增強： -OH、-OR、-NH2、-CN等。 吸電子基團會使熒光減弱： -COOH、-NO2、-SH、-X等,鹵素取代基: 隨著取代基中鹵原子系數(shù)的增加，使系間竄躍加強，物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強,64,溫度：溫度越高，熒光降低,環(huán)境對熒光的影響,溶劑：極性增加，熒光增強，熒光波長發(fā)生紅移,pH值：電離平衡的改變導致熒光強度的差異,猝滅劑：動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、自猝滅,表面活性劑：保護處于激發(fā)單重態(tài)的熒光物質(zhì)分子， 提高熒光效率,65,pH對熒光強度的

19、影響,共軛酸堿兩種體型具有不同的電子氛圍，往往表現(xiàn)為具有不同熒光性質(zhì)的兩種體型，各具有自己特殊的熒光效率和熒光波長,離子化后，熒光消失,pH1有熒光,pH13無熒光,66,四、熒光光譜儀,67,測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。 特殊點： 1.有兩個單色器 2.光源與檢測器通常成直角,儀器結(jié)構(gòu),69,熒光光度計光路圖,70,熒光分光光度計的的主要部件 激發(fā)光源：穩(wěn)定、具有一定強度（300400nm) 樣品池：低熒光材料，常用石英池，方形 檢測器：較高靈敏度 單色器（激發(fā)單色器和發(fā)射單色器）：光柵,儀器結(jié)構(gòu),71,1個光子可產(chǎn)生106107個電子,光電倍增

20、管(Photomultiplier Tube, PMT,72,儀器的使用維護,注意事項 電源：觸發(fā)電壓、工作電流、穩(wěn)定性 光源：啟動預(yù)熱、冷卻重啟、保持清潔 單色器：防潮、防塵、防污和防機械損傷 光電倍增管：避免高壓時受到外來光線直射 樣品池：插放方向、避免摩擦、清洗 個人防護 ： 避免紫外線損傷,73,五、熒光分析方法與應(yīng)用,74,優(yōu)點： （1）靈敏度高 比紫外-可見分光光度法高23個數(shù)量級； （2）選擇性強 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜； （3）試樣量少 、方法簡便、提供比較多的物理參數(shù) 缺點： 應(yīng)用范圍小。 60余種元素，尤其適用于有機物和生物大分子的檢測,熒光分析法的特點

21、,75,熒光信號,熒光壽命 熒光光譜 熒光強度隨光譜變化 成像（熒光物質(zhì)在樣本中分布的空間信息） 強度 壽命,76,可獲得的信息,分子結(jié)構(gòu)信息：熒光發(fā)射波長，熒光壽命，大分子表面熒光物質(zhì)的熒光強度隨溶劑極性的變化等等 分子濃度信息：熒光強度增強或猝滅 分子在溶劑中的狀態(tài)：熒光光譜的紅移或者藍移，靜態(tài)或動態(tài)猝滅，熒光壽命的變化等等 分子間的相互作用：熒光猝滅，熒光壽命，共振能量轉(zhuǎn)移、新的熒光峰的產(chǎn)生 分子的大?。悍肿拥霓D(zhuǎn)動速度對偏振光的消偏等,77,熒光分析法對物質(zhì)的定性或定量分析,定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所吸收波長和發(fā)射的熒光波長不同,定量分析：同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強度與濃度呈線

22、性關(guān)系,78,任何熒光化合物都具有兩種特征光譜： 熒光激發(fā)光譜（吸收光譜）固定某一發(fā)射波長，測定該波長下的熒光發(fā)射強度隨激發(fā)波長變化所得的光譜。 熒光發(fā)射光譜（熒光光譜）固定某一激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射強度隨發(fā)射波長變化得到的光譜,熒光分析法定性依據(jù),79,1)定量依據(jù) 熒光強度 F正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率f ： F = f Ia 由朗-比耳定律： Ia =I0-I=I0 (1-10- l c ) F= f I0(1-10- l c ) = f I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低（ l c 0.05）時，將括號項近似處理后： F= 2.3 f I0 l c = K c,熒光分析

23、法定量依據(jù)和方法,80,熒光的定量分析,熒光強度與溶液濃度的關(guān)系：F=Kc,81,一般當b c 0.05 時, F與c呈線性關(guān)系,濃度對熒光強度的影響,82,定量分析方法,標準曲線法 比例法 解線性方程法,83,標準曲線法,熒光強度,濃度,FX,CX,84,比例法,FS=KCS FX=KCX Fs F0 CS Fx F0 CX CX CS (Fx F0 )/ (Fs F0,85,解線性方程法,多組分混合物的熒光分析也可以象吸收分光光度法一樣利用熒光強度的加和性質(zhì)，采用解線性方程組的方法、雙波長及多波長等方法從混合物中不經(jīng)分離即可測得被測組分的含量,86,熒光分析法的應(yīng)用,單組分的熒光直接測定和

24、間接測定,多組分的熒光測定,87,單組分的熒光直接測定和間接測定,熒光物質(zhì),大多數(shù)無機和有機 化合物,化學反應(yīng),熒光猝滅,88,1)無機化合物的分析 可測量約60多種元素： 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光配合物分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定,單組分的熒光測定,89,2) 有機化合物的分析 芳香族化合物具有共軛不飽和體系，多能發(fā)生熒光。 脂肪族化合物往往與熒光試劑作用后才可產(chǎn)生熒光。 胺類、甾族化合物、蛋白質(zhì)、酶和輔酶、維生素等均可以用熒光法分

25、析,90,多組分混合物的熒光分析,兩組分的熒光光譜峰不重疊：可選用不同的發(fā)射波長來測定各組分的熒光強度 兩組分的熒光光譜峰重疊或接近：可選用不同的激發(fā)波長來測定,91,六、磷光光譜法,92,磷光光譜法,磷光分析法是以分子磷光光譜來鑒別有機化合物和進行定量分析的一種方法,93,磷光光譜法,磷光光譜分析法的分類,低溫磷光,室溫磷光,1、固體表面室溫磷光法（SS-RTP） 2、膠束增穩(wěn)室穩(wěn)磷光法（MS-RTP,94,1.稠環(huán)芳烴分析 2.農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析 3.藥物分析和臨床分析,磷光光譜法的應(yīng)用,95,七、化學發(fā)光光譜法,96,基本原理,在化學反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，

26、從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光，稱為化學發(fā)光,A +B = C + D* D* D + h,97,化學發(fā)光的特點,能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物； 化學發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當 E=170300 kJ/mol；位于可見光區(qū)； 發(fā)光持續(xù)時間較長，反應(yīng)持續(xù)進行,98,化學發(fā)光的效率,化學效率,發(fā)光效率,99,時刻t的化學發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù),化學發(fā)光的效率,100,化學發(fā)光分析法定量分析依據(jù)： 從上式可以看出：發(fā)光總強度與分析物濃度成正比,直接發(fā)光 A + B C* + D C* C + h,化學發(fā)光反應(yīng)類型,1. 直接化學發(fā)光和間接化學發(fā)光,間接發(fā)光 A + B C* + D C*+F F* + E F* F