酶底物法(科立得)產(chǎn)品培訓

1、總大腸菌群 / 大腸埃希氏菌 及耐熱(糞)大腸菌群固定底物技術(shù)酶底物法,微生物檢測的重要性,地震等自然災害過后水體中會被大量微生物所污染，特別是糞便污染，如水體中含有腸道病原菌株，并被人飲用則會爆發(fā)嚴重疾病如泌尿系感染、菌血癥和腦膜炎，少數(shù)腸道病原菌株可引起急性腹瀉。 通常人們用投放含氯消毒劑進行消毒，但消毒效果如何還需要通過檢測水體中是否含有總大腸菌群和大腸埃希氏菌來判斷,指示菌的方法學定義,總大腸菌群（Total Coliforms) 大腸菌群系指一群在37培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指標菌的一般特征故以此作為糞便污染

2、指標評價飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。 耐熱大腸菌群(Thermotolerant Coliforms) ，原名：糞大腸菌群（Fecal Coliforms ) 用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群。是水體受人畜糞便污染的比較直接指標。 大腸埃希氏菌（大腸桿菌，E.Coli.) 大腸埃希氏菌是指能產(chǎn)生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside）使培養(yǎng)液呈黃色，能產(chǎn)生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-

3、umbelliferyl-D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的細菌。大腸埃希氏菌是糞大腸菌群的組成部分，是水體受人畜糞便污染的最直接指標，水中含有大腸埃希氏菌提示有糞便污染,背景知識 大腸菌群，耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌,耐熱大腸菌群,大腸埃希氏菌,大腸菌群,目前的糞大腸菌群檢測方法是實際上是檢測耐熱大腸菌群而不是大腸埃希氏菌。有關(guān)文獻報道的試驗結(jié)果表明, 有15%的陽性耐熱糞大腸菌群實際上屬于總大腸菌群而不是大腸埃希氏菌。這種情況的發(fā)生多數(shù)是由于耐熱的克雷伯氏菌普遍存在于自然環(huán)境中，而非來源于人畜糞便，因此與人類疾病的產(chǎn)生也沒有絕對的關(guān)聯(lián)。同時，（用上述方法

4、檢測）會有10%的假陰性結(jié)果，是因為大腸埃希氏菌屬有10不會產(chǎn)氣（注1）。注1：目前的糞大腸菌群檢測方法，產(chǎn)酸產(chǎn)氣是預試驗的陽性判斷指標,糞便污染指示菌比較,我國水質(zhì)微生物指標(細菌,檢測方法,多管發(fā)酵法（Multiple Tube Fermentation, MTF) 濾膜法（Membrane Filtration, MF ) 固定底物技術(shù)酶底物法(Defined Substrate Technology, DST) 酶底物法( Enzyme Substrate Test, EST,檢測方法,多管發(fā)酵法（MTF）共需3-5天時間 以100mL水樣中大腸菌最可能數(shù)(most probable

5、number, MPN)表示 培養(yǎng)基制備試管培養(yǎng)（2226小時） 陰性結(jié)果（無產(chǎn)酸，產(chǎn)氣） 產(chǎn)酸，產(chǎn)氣 平板培養(yǎng)1824小時 革蘭氏染色，鏡檢 觀察菌落形態(tài)，挑取特征菌落 證實試驗（培養(yǎng)242h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群存在,檢測方法,濾膜法（membrane filtration,MF ) 共需2-3天時間 用孔徑為0.45的微孔濾膜過濾水樣，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，計數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù) ,計數(shù)單位為菌落形成單位CFU(colony forming unit) 儲備培養(yǎng)基的制備過濾（需器械滅菌等）培養(yǎng)（22-24H） 陰性結(jié)果(無典型菌

6、落） 革蘭氏染色 鏡檢 觀察菌落形態(tài),挑取特征菌落 證實試驗（培養(yǎng)242h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群存在,酶底物法總大腸菌群 陽性反應原理,半乳糖醛苷,半乳糖苷酶,酶底物法大腸埃希氏菌 陽性反應原理,葡萄糖醛酸酶,4-甲基-傘形葡萄糖苷酸,1, 方法 本標準方法采用固定底物技術(shù)酶底物法 Defined Substrate Technology, DST 2，培養(yǎng)基： 采用Minimal Medium ONPG-MUG，簡稱 MMO-MUG培養(yǎng)基 3, 優(yōu)點 假陽性,假陰性底 操作簡單,快速 定性,定量（51孔/97孔定量盤法） 50多個國家和組織認證 世界衛(wèi)生組織WHO,美國EPA,水

7、與廢水標準檢驗法,生活飲用水標準檢驗方法對酶底物法定義,科立得 應用,飲用水 源水 瓶裝水 再生水,廢水 食品水 畜牧用水 醫(yī)療用水,收錄于“標準測試法”內(nèi) APHA(美國公共衛(wèi)生協(xié)會), US EPA, AOAC, US NCIMS, UK DWI , IBWA ,WHO,假陽性比較： vs 濾膜法,假陽性比較：vs 濾膜法,Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker et al, Water Res., 1997,報告者：英國泰晤士水務 樣品來源：泰晤士河，樣品數(shù)450個,假陽性比較 vs 濾膜法,Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker

8、et al, Water Res., 1997,產(chǎn)生的原因 傳統(tǒng)方法培養(yǎng)基非選擇性,會產(chǎn)生相似結(jié)果引起假陽性反應 培養(yǎng)基污染 樣品交叉污染 操作誤差 結(jié)論 試驗證明可以用Colilert取代濾膜法進行大腸菌群和大腸埃希氏菌，還證明了ColilertDST酶底物法是不受化學、外力等外界因素變化而變化的,假陰性比較： vs 濾膜法及多管法,Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker et al, Water Res., 1997,假陰性率產(chǎn)生的原因 由于是非特異培養(yǎng)基所以會有雜菌干擾 清潔劑、鹽、 抗生素、毒素、溫度等原因會造成抑制反應 非發(fā)酵大腸菌 膜過濾法的問題 過濾膜

9、的損壞,Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker et al, Water Res., 1997,實驗步驟：Colilert 對比濾 膜 法,濾膜法 72步,科立得:5步,實驗步驟：97孔定量盤法 vs 多管發(fā)酵,測試時間比較表,經(jīng)濟成本分析,定性檢測操作示范 2步法,加入科立得試劑， 搖晃至溶解,36C培養(yǎng)24小時，判斷結(jié)果: 1,無顏色變化陰性 2,黃色總大腸菌群陽性 3，黃色且熒光大腸埃希氏菌陽性 44.5 培養(yǎng)24小時,判斷結(jié)果： 1、無顏色變化陰性 2、黃色糞大腸菌群陽性,定量檢測（51孔定量盤） 5步法,加入科立得試劑后， 搖晃至溶解,將Colilert溶

10、液倒入 51孔（或97孔）定量盤Quanti-Tray內(nèi),將定量盤Quanti-Tray放入 程控定量封口機Sealer封口,36 或44.5 培養(yǎng)24后，計算呈陽性 反應的格子，然后對照MPN表 計數(shù),定量檢測（51孔定量盤） 5步法,固定底物技術(shù)酶底物法 科立得 所需試劑及設(shè)備,定性 科立得試劑 取樣瓶（可用玻璃瓶替代,定量 科立得試劑 取樣瓶（可用玻璃瓶替代） 51孔/97孔定量盤 程控定量封口機,Colilert 使用總結(jié),科立得市場占有率,美國的市場占有率為95% 歐洲的市場占有率為90% 全國有20余家環(huán)境監(jiān)測站（如北京、上海、四川、廈門、鄭州、沈陽等） 、40余家自來水公司、35家省市級疾病預防控制中心及水文站,應用案例,2004年非典愛德士捐贈科立得試劑給中國CDC及上海CDC抗拒非典 2008年汶川地震愛德士公司捐贈1000套科立得試劑到四川省CDC及環(huán)境監(jiān)測站 2008年奧運會協(xié)助北京自來水及北京CDC完成奧運安全供水任務 與中國環(huán)境監(jiān)測站、上海環(huán)境監(jiān)測站及廈門環(huán)境監(jiān)測站做了對比實驗,案例分析,2004年非典愛德士捐贈科立得試劑給中國疾病預防控制中心及上海中國疾病預防控制中心抗拒非典,案例分析2008年汶川地震愛德士公司捐贈1000套科立得試劑到四川省CDC及環(huán)境監(jiān)測站第一家捐贈試劑到災區(qū)的廠家,案例分析2008年奧運會協(xié)助北京自來水及北京CDC