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文檔簡介
1、比較細(xì)胞表面黏附分子在牽張力引起的HL近年來研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化和高血壓的發(fā)生與血管炎癥反應(yīng)存在著緊密聯(lián)系,動脈內(nèi)膜出現(xiàn)脂質(zhì)斑點、粥樣或纖維樣斑塊等炎性病變,使血管壁增厚和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損造成血管硬化和血管阻力增高是高血壓發(fā)生、發(fā)展的重要原因。許多炎癥因子可以通過直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致其功能紊亂和血管張力失調(diào),從而參與高血壓發(fā)生和發(fā)展的病理過程。內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)貯存著大量的生物活性物質(zhì),包含前炎癥因子與前凝血因子,例如: P-選擇素( P-selectin) 、E-選擇素( E-selectin) 、細(xì)胞間黏附分子-1( intercellular adhesion molecular-1,I
2、CAM-1) 和血管細(xì)胞黏 附 分 子-1 ( vascular cell adhesion molecular-1,VCAM-1) 和血管假性血友病因子 ( von Willebrandfactor,vWF) 等,這些分子與細(xì)胞黏附、炎癥、血栓形成及止血密切相關(guān)。有報道顯示血壓升高引起的牽張力長期作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞會引起炎癥因子釋放增加,多種細(xì)胞黏附分子表達水平升高,機械性牽張力通過改變內(nèi)皮細(xì)胞表面血管黏附分子和栓塞分子的表達來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血栓形成。我們前期研究發(fā)現(xiàn) P-selectin 在機械性牽張力誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞黏附過程中發(fā)揮十分重要的作用,它可以明顯促進炎癥細(xì)胞黏附,而 VCAM-1
3、 在受血管牽張力刺激后在黏附過程中是否起作用以及 P-selectin 和 VCAM-1引起的炎癥細(xì)胞黏附能力強弱的比較還未見報道。1 材料和方法1 1 材 料HL-60 人白血病淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞株來自于ATCC 細(xì)胞庫,M199 培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Gibco 公司,青霉素、鏈霉素和化學(xué)試劑購自 Sigma 公司; 小鼠抗 P-selectin 抗體、小鼠抗 VCAM-1 抗體和 IgG2a 同型對照抗體購自 BD 公司; S100 倒置相差顯微鏡、體視顯微鏡購自 Nikon 公司、國產(chǎn)玉兔牌血壓計購自北京王府井醫(yī)藥器械公司、離體血管分析儀購自 Living systems 公司、XC-S
4、T50CE 型攝像機及顯示器購自 SONY 公司、注射泵購自 HAVAD 公司; 8 10 周C57BL /6J SPF 級小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。1 2 方法本實驗是建立在離體小鼠頸總動脈上的黏附模型。實驗前用血壓計校準(zhǔn)壓力感受器、校準(zhǔn)血管直徑測量標(biāo)尺,并用生理鹽水灌流血管分析儀液體循環(huán)管道并排空氣泡。1 2 1 不同牽張力刺激小鼠頸總動脈誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞黏附實驗 小鼠左右頸總動脈分離后在 0 01 g/L BSA 的 M199 中饑餓處理 2 h,接入由注射泵、血管灌流槽和三通管組成的灌流系統(tǒng),并由壓力感受器實時監(jiān)測血管條內(nèi)部的壓力。用生理鹽水平衡 15 min,然
5、后通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)部壓力,分別維持在75、100、125、150 mmHg 下處理30 min,測量血管直徑。用含0 01 g / L BSA 的 M199 重懸HL-60細(xì)胞,計數(shù)后將 5 × 106/ mLHL-60 細(xì)胞約 3 mL 緩慢灌入血管腔,靜置 30 min,使其與血管壁相互作用并黏附。為了避免因液體流動帶來的剪切力,灌流速度設(shè)置為 0 37 mL/min。最后用生理鹽水在低壓下灌流10 min,沖洗掉未黏附的細(xì)胞,在 10 倍物鏡下拍照。實驗結(jié)果由每個視野中黏附的細(xì)胞數(shù)得來。1 2 2 高機械牽張力刺激下 VCAM-1、P-selectin 影響 HL-60細(xì)胞黏附
6、實驗 小鼠左右頸總動脈分離、預(yù)處理和灌流系統(tǒng)連接同上,由壓力感受器實時監(jiān)測血管條內(nèi)部的壓力。用生理鹽水平衡 15 min,然后分別灌流含有小鼠 VCAM-1 抗體、同型 IgG 對照抗體以及 P-selectin 抗體的生理鹽水,濃度為10 μg / mL,通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)部壓力,維持在 150 mmHg,對血管做30 min 預(yù)處理,以75 mmHg 做對照。為了避免因液體流動帶來的剪切力,灌流速度設(shè)置為 0 37 mL/min。用含0 01 g / L BSA 的 M199 重懸 HL-60 細(xì)胞,計數(shù)后將 5 × 106/ mLHL-60細(xì)胞約 3 mL 緩慢灌入血管腔,
7、分別維持在150 mmHg或75 mmHg 靜置 30 min,使其與血管壁相互作用并黏附。最后用生理鹽水在低壓下灌流 10 min,沖洗掉未黏附的細(xì)胞,在10 倍物鏡下拍照。實驗結(jié)果由每個視野中黏附的細(xì)胞數(shù)得來。1 2 3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用 SPSS20 0 進行統(tǒng)計分析,結(jié)果以 x ± s 表示,以單因素方差分析,P 0 05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2 1 機械牽張力引起小鼠頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞上 HL-60細(xì)胞黏附增加小鼠頸總動脈管腔內(nèi)壓力從 75 mmHg逐漸升高至 150 mmHg,血管隨之直徑加大,高壓下管腔直徑相對于低壓時擴大約 150% ( 圖 1A)
8、,隨著壓力升高,血管及內(nèi)皮細(xì)胞受到的機械牽張力也隨之加大。血管內(nèi)皮細(xì)胞在不斷增大的牽張力的刺激下,使得 HL-60 細(xì)胞黏附逐漸增多,證明機械牽張力能引起 HL-60 細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上黏附,并呈明顯的牽張強度依賴性( 圖 1B) 。2 2 機械牽張力通過 VCAM-1 和 P-selectin 介 導(dǎo)HL-60 細(xì)胞的黏附為證明黏附過程是由 VCAM-1參與 完 成 的,在 加 入 HL-60 細(xì) 胞 之 前 分 別 用10 μg / mL VCAM-1 中和抗體、非特異的同型 IgG 對照抗體和 P-selectin 中和抗體,分別對不同的血管條進行預(yù)處理。結(jié)果表明高腔內(nèi)壓能顯著的引起
9、由VCAM-1 參與的 HL-60 細(xì)胞黏附過程,高壓處理后的血管壁上黏附的 HL-60 細(xì)胞明顯多于低壓處理組,而加入 VCAM-1 中和抗體、P-selectin 中和抗體預(yù)處理后的血管,HL-60 細(xì)胞黏附數(shù)目與非特異性 IgG 預(yù)處理后的黏附細(xì)胞數(shù)目相比有顯著的降低,IgG 組與高壓組無明顯區(qū)別( 圖 2 ) 。從而證明了機械牽張力通過引起 VCAM-1 在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移增加來促進HL-60細(xì)胞的黏附,其作用與 P-selectin 介導(dǎo)的細(xì)胞黏附水平相似。3 討論血管及其內(nèi)皮細(xì)胞在心臟有規(guī)律搏動輸出血液的刺激下,受到平行于血管的剪切力和垂直于血管的牽張力兩種機械力作用,其中牽張力是內(nèi)
10、皮細(xì)胞感受的重要機械力之一,其廣泛存在于多種生理、病理條件下。多項研究表明,高血壓時動脈系統(tǒng)擴張,引起牽張力增加,異常的機械力作用于內(nèi)皮細(xì)胞造成內(nèi)皮受損,細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活,導(dǎo)致一系列炎癥因子釋放增加,炎癥細(xì)胞活化后釋放多種酶,溶解破壞內(nèi)皮細(xì)胞,引發(fā)的炎癥反應(yīng)使血管壁增厚,造成血管硬化、血管阻力增高血壓升高。有文獻報導(dǎo)機械力通過激活細(xì)胞膜上多種信號分子,引起內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),這些轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、功能和基因表達起著重要的作用。因此,深入研究機械力學(xué)刺激導(dǎo)致或加重高血壓形成的機制,減少炎癥因子產(chǎn)生,對于預(yù)防高血壓的發(fā)生發(fā)展有著重要作用。目前的研究大部分局限于內(nèi)皮細(xì)胞黏
11、附作用的探討,而對離體組織器官的研究則相對缺乏,故本研究主要針對機械牽張力對離體小鼠頸動脈內(nèi)皮的作用及細(xì)胞黏附展開。為了模擬高血壓時血管受力情況,實驗采用 Living systems 血管加壓裝置,通過施加不同程度的靜水壓,模擬體內(nèi)升壓所致動脈內(nèi)皮受到不同的牽張應(yīng)力。內(nèi)皮細(xì)胞表面存在多種炎癥細(xì)胞黏附因子,目前有關(guān) P-selectin、VCAM-1 等糖蛋白分子研究較多。先前,我們證明了 P-selectin 在牽張力引起的細(xì)胞黏附過程中起重要作用,VCAM-1 是否也在其中起作用還不得而知。VCAM-1 是表達于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的免疫球蛋白黏附分子,可與白細(xì)胞表面的 VLA-4 整合蛋白相
12、結(jié)合,引起白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動、黏附。現(xiàn)已證實血液流動剪 切 力 可 引 起 黏 附 分 子 調(diào) 控 變 化, VCAM-1、E-selectin 都具有剪 切 應(yīng) 力 的 依 賴 性,提 示VCAM-1 在牽張力引起的細(xì)胞黏附過程中有可能起一定的作用。本研究結(jié)果首先顯示牽張力可以顯著刺激HL-60細(xì)胞黏附,并呈壓力強度依賴性關(guān)系。接著,我們就VCAM-1 在機械牽張力誘導(dǎo)血管炎癥細(xì)胞黏附過程中的作用進行了探討。我們發(fā)現(xiàn)機械牽張力不僅可以影響由 P-selectin 介導(dǎo)的 HL-60 細(xì)胞黏附,同時也可以通過調(diào)控 VCAM-1 的變化來影響 HL-60 細(xì)胞黏附,并且水平接近。綜上所述,
13、本研究結(jié)果顯示 VCAM-1 和 P-selectin參與了由牽張力誘導(dǎo)的 HL-60 細(xì)胞黏附過程,提示機械牽張可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。目前該結(jié)論僅來自于離體小鼠頸動脈的黏附模型,VCAM-1 和 P-selectin 引起細(xì)胞黏附增多的分子機制以及體內(nèi)血壓升高時細(xì)胞黏附的情況,還有待于在分子水平、高血壓動物模型上得到進一步揭示和驗證。深入研究機械牽張力調(diào)控炎性細(xì)胞黏附的機制,將有助于豐富和完善高血壓發(fā)病機制的理論,降低血栓和高血壓的發(fā)生,為探索新的臨床治療方法提供思路。參考文獻:1Leibowitz A,Schiffrin EL Immune mechanisms in hypertensionJCurr Hypertens Rep,2011,13( 6) : 465 4722Detmar M,Brown LF,Schn
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