自制泡菜汁中分離獲得植物乳桿菌

1、自制泡菜汁中分離獲得植物乳桿菌益生菌作為一種新型綠色飼料添加劑,受到各國研究者的重視,有著良好的發(fā)展前景。益生菌是對宿主有益的一類活性微生物,作用于人及動物體腸道和生殖系統(tǒng)等,可改善宿主腸道微生態(tài)平衡,發(fā)揮有益作用。而乳酸菌作為一類應用廣泛的益生菌,是動物腸道中的優(yōu)勢菌群,其無毒、無殘留及無抗藥性備受關注。植物乳桿菌是一種常見于發(fā)酵肉類、蔬菜和果汁中的乳酸菌,是人和動物腸道內(nèi)的主要菌群,呈革蘭陽性桿菌,不形成芽孢、無鞭毛及不運動,過氧化氫酶試驗呈陰性,能夠產(chǎn)生細菌素等抑菌物質(zhì),可抑制革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌的生長,有研究表明飼喂植物乳桿菌可顯著地提高仔豬的飼料轉(zhuǎn)化率(P1、材料與方法1.1

2、材料1.1.1分離材料自制泡菜汁作為分離菌種的材料。1.1.2菌種植物乳桿菌購自中科院微生物菌種保藏中心,作為生理生化鑒定中的模式菌株,在MRS培養(yǎng)基上常規(guī)培養(yǎng)。1.1.3供試主要培養(yǎng)基和試劑MRS培養(yǎng)基,MRS+碳酸鈣培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基等;十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)堿和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)等細菌DNA提取的試劑為進口,16SrDNAPCR擴展引物F:(5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 )和R:(5 -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 )由上海生物工程有限公司合成。dNTP、TaqDNA聚合酶等均購自生物工程(上海)有限

3、公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.1.4試驗儀器見表11.2方法1.2.1植物乳桿菌的分離純化取自制泡菜汁,用滅菌氯化鈉注射液稀釋到10-4倍,取100μL涂布于MRS+碳酸鈣培養(yǎng)基平板上,37厭氧培養(yǎng)2448h后,采用四分區(qū)劃線法,挑取產(chǎn)生溶鈣圈且菌落形態(tài)疑似植物乳桿菌的菌落形態(tài)的菌株,在MRS培養(yǎng)基平板上進行分離純化培養(yǎng),經(jīng)2448h培養(yǎng)后,挑取分離效果較好的菌株,用接種環(huán)接種于斜面上(MRS)進行純培養(yǎng),于4冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2生理生化鑒定參照東秀珠的常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊和第八版伯杰系統(tǒng)鑒定手冊中的植物乳桿菌的生理生化鑒定的試驗要求進行鑒定。1.2.316SrDNA分子鑒定

4、通過生理生化試驗初步篩選出的植物乳桿菌進行基因組DNA鑒定,DNA提取法參照姜云等的方法,采用改良CTAB法提取。通過引物F及R對疑似植物乳桿菌的16SrDNA基因片段進行PCR擴增,PCR擴增體系(25μL)及反應條件見表2,電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量,并回收純化PCR產(chǎn)物,在中科院微生物所測定疑似植物乳桿菌DNA序列。將所得序列與GenBank中的16SrDNA序列進行BLAST比對,獲得相似的序列與系統(tǒng)發(fā)育相關的物種,用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育分析。2、結(jié)果與分析2.1細菌的初步分離觀察通過MRS+碳酸鈣培養(yǎng)基對泡菜汁進行細菌分離,共獲得3株疑似植物乳桿菌的菌株,并

5、將這3株菌分別編號為HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117。以上3株細菌在MRS培養(yǎng)基上用牙簽挑起可形成黏液狀拉絲,革蘭陽性,無芽孢、莢膜及鞭毛,菌體有細長彎曲桿狀,排列無序,也有對生,兩端頓圓,棒形球桿狀。菌株的培養(yǎng)特征及菌體特性見表3。從圖1可見:HEW-Z117在加鈣MRS培養(yǎng)基上,單個菌落能形成410mm溶鈣圈。2.2生理生化鑒定結(jié)果分離獲得的3株細菌生理生化鑒定結(jié)果見表4,3株菌均可以在10和45下生長且氧化酶試驗為陽性,精氨酸雙水解酶為陰性;其他反應見表4,通過與植物乳桿菌模式菌株比較可初步鑒定HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117為植物乳桿菌。2.31

6、6SrDNA分子鑒定結(jié)果通過CTAB法提取獲得菌株HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117的基因組DNA,然后分別對HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117的16SrDNA進行PCR擴增,結(jié)果表明,通過PCR擴增獲得了菌株HEW-A106、HEW-A111和HEW-A117的16SrDNA片段,片段大小均在1500bp左右,見圖2,對獲得的16SrDNAPCR產(chǎn)物進行測序,獲得菌株HEW-A106、HEW-A111和HEW-A117的16SrDNA序列,大小分別為1425、1467和1434bp。用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,從圖3可見:菌株HEW-Z106、HEW-

7、Z111和HEW-Z117均與植物乳桿菌聚于同一分支,同源性均達到了99%。通過菌株HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117的形態(tài)特征、生理生化反應及16SrDNA特征,鑒定菌株HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117均為植物乳桿菌。3、討論動物腸道是消化道中重要的吸收場所,也是其最大的免疫器官。腸道中存在大量的微生物菌群。他們協(xié)同作用,防止外源病原菌突破這道屏障,以達到維護機體健康的效果。植物乳桿菌是動物腸道菌群的一種共生菌,能夠產(chǎn)生乳酸菌素,可有效抑制消化道中的病原菌(大腸桿菌和沙門菌)的生長,維持動物腸道的微生態(tài)平衡,從而達到防治疾病的效果,不但解決了抗生素使用所

8、產(chǎn)生的殘留問題,而且能夠提高動物飼料轉(zhuǎn)化率。研究通過選擇培養(yǎng)基從泡菜汁中分離獲得了3株疑似植物乳桿菌的菌株,通過形態(tài)學鑒定、生理生化鑒定和16SrDNA分子鑒定發(fā)現(xiàn),3株菌均為植物乳桿菌,即HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117。研究獲得的植物乳桿菌通過發(fā)酵生產(chǎn)并處理加工后,作為飼料添加劑應用于動物,無害、無污染且安全。目前,國內(nèi)外對植物乳桿菌的研究已經(jīng)廣泛開展,并取得了一定的成效,歐盟及其他國家也已將植物乳桿菌作為飼料添加劑中微生態(tài)制劑菌種的一種。我國是植物乳桿菌等乳酸菌資源比較豐富的國家,對其進一步研究起步較晚。近年來,植物乳桿菌已經(jīng)引起眾多研究人員對乳酸菌、益生素、食品添加劑、飼料添加劑及新藥品開發(fā)等的研究。植物乳桿菌不僅能夠使動物腸道環(huán)境偏酸,不利于病原菌生長,而且能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì),抑制病原菌的侵入。研究僅對分離獲得的菌種進行了鑒定,將對其他益生性能做進一步研究,將深入探討這3株植物乳桿菌的益生性,及其在動物微生態(tài)制劑中的應用效果,仍需要動物飼養(yǎng)試驗才能確定。參考文獻:1楊雪海,趙娜,魏金濤,等.植物乳桿菌對致病性大腸桿菌的抑制效果研究J.飼料研究,2011(1):27-28.2侯成立,季海峰,周雨霞,等.植物乳桿菌對斷奶仔豬