芴對斑馬魚不同發(fā)育時期的毒性作用對比

1、芴對斑馬魚不同發(fā)育時期的毒性作用對比芴( fluorene) 是美國國家環(huán)境保護局( USEPA) 優(yōu)先控制的16 種多環(huán)芳烴( polycyclic aromatic hydrocar-bons，PAHs) 之一，是一種介于 2 環(huán)與 3 環(huán)之間的多環(huán)芳烴，主要來源于石油、木材、煤炭等的燃燒和海上石油開發(fā)運輸中的泄漏。芴等多環(huán)芳烴會被水體中的懸浮顆粒物吸附，從而大量沉積在水底，但由于沉積物固相-水相間頻繁的物質(zhì)交換，沉積物中所吸附的PAHs 也會被沉積物中的底棲生物吸收，并通過食物鏈富集放大，進而大量富集于各種魚類體內(nèi)，最終危及到人類的健康并導(dǎo)致海洋生態(tài)平衡的破壞。芴與萘在包括飲用水在內(nèi)的國

2、內(nèi)外各種水體中被廣泛檢出，且國內(nèi)水體中含量普遍高于國外。斑馬魚( Brachydanio rerio) 的小規(guī)模飼養(yǎng)技術(shù)簡單，遺傳背景清晰，與人類基因組同源性高，常年產(chǎn)卵，魚卵透明易收集，仔魚發(fā)育迅速，對有毒化合物敏感。1996 年斑馬魚胚胎發(fā)育方法被經(jīng)濟合作與發(fā)展組織( OECD) 制定為測定單一化學(xué)品毒性的標準方法之一。近年來，國內(nèi)外開始逐步利用包括斑馬魚在內(nèi)的魚類胚胎，研究 PAHs 的致畸性和作用機理，但多集中于萘、菲、苯并a芘等常見 2 環(huán)、3 環(huán)、5 環(huán)PAHs，對芴的研究較少。本研究采用芴對斑馬魚成魚及2 個不同發(fā)育時期的斑馬魚胚胎進行染毒實驗，研究其對斑馬魚的毒性效應(yīng)，尋找芴對

3、斑馬魚作用的最敏感時間與靶器官，旨在為進一步研究 PAHs 對魚類不同發(fā)育階段的毒性效應(yīng)提供借鑒。1、 材料與方法( Materials and methods)1 1 實驗動物產(chǎn)卵種魚與急性毒性實驗用魚分批購買，分缸飼養(yǎng)，平均體長分別大于 4 5 cm 與 2 5 cm。種魚于產(chǎn)卵前馴化 3 個月以上，實驗用魚馴化 1 個月以上。兩缸飼養(yǎng)用水均為曝氣自來水，溶解氧為( 9 10 ±0 08) mg·L-1，水溫保持為( 26 ±1) ，pH 控制在 8左右，光照/黑暗周期控制為 14 h 10 h。每天投喂經(jīng)消毒處理的冷凍紅蟲飼料 2 次。1 2 試

4、劑芴( 99 5%) 購自天津光復(fù)精細化工研究所，丙酮( 99 5%) 購自天津江天統(tǒng)一科技有限公司。芴難溶于水，故需要選用助溶劑助溶。Hallare 等通過實驗對比乙醇、二甲基亞砜、丙酮等助溶劑，證明丙酮對斑馬魚影響最小。本實驗選用丙酮作為助溶劑，且通過實驗發(fā)現(xiàn)當丙酮濃度小于 0 5% ( 質(zhì)量分數(shù)) 時，斑馬魚成魚與胚胎發(fā)育不受影響。本實驗最大助溶劑濃度不超過 0 5%( 質(zhì)量分數(shù)) 。1 3 實驗方法1 3 1 成年斑馬魚染毒實驗設(shè)計按照危險化學(xué)品魚類急性毒性分級試驗方法( GB/T212812007) 設(shè)計實驗，以 1 000 mL 燒杯為受試用具，配制5 組質(zhì)量濃度間隔較大的溶液 5

5、0、10、5、1、0 5 mg·L-1，并設(shè)置不加毒物的空白對照組進行預(yù)實驗。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在96 h 絕對致死濃度10 mg·L-1與96 h 最大耐受濃度1 mg·L-1間，按等對數(shù)間距配制5 個濃度807、5 30、3 49、2 30、1 52 mg·L-1，同時設(shè)置未染毒空白對照。每個濃度放入 10 尾成年斑馬魚，每個濃度設(shè)置 3 組平行實驗，以保鮮膜覆蓋燒杯口，以免溶液揮發(fā)。采用靜態(tài)置換法每天更新溶液的一半，以保證溶液濃度的穩(wěn)定。更新溶液后，溶液中溶解氧濃度略有下降，穩(wěn)定于( 7 07 ±0 22) mg&mid

6、dot;L-1。觀察24 h、48 h、72 h 和96 h 的成魚活動和中毒癥狀，拍照并記錄各時間段魚類死亡數(shù)。1 3 2 斑馬魚胚胎染毒實驗設(shè)計種魚在早晨給光 30 min 內(nèi)完成交配，于倒置顯微鏡下選取發(fā)育正常魚卵，用于毒性實驗。共配制 50、10、5、1、0 5、0 1 mg·L-1共 6 組濃度的芴水溶液對魚卵進行預(yù)染毒實驗，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選取 5 個濃度( 10、8、5、2、1 mg·L-1) 進行正式實驗。按照 Schulte 等的研究方法設(shè)計實驗，選用24 孔細胞培養(yǎng)板作為魚卵受試器具，每塊細胞培養(yǎng)板為 1 個濃度，每孔容積 3 mL，實驗時每孔加入

7、 2mL 試劑，并置入 1 枚發(fā)育正常的魚卵。24 孔中，前20 孔為同一濃度，后 4 孔為空白對照。將每塊細胞培養(yǎng)板用保鮮膜封好，并放入事先設(shè)置好的溫度為( 28 ±1) ，光暗比為 14 h 10 h 的光照培養(yǎng)箱中?？紤]受試試劑對斑馬魚胚胎毒性作用時間的差異，魚卵實驗共進行 2 組，濃度相同，分別為 0 hpf( hourspast fertilization) 染毒組與 10 hpf 染毒組。10 hpf 染毒組實驗魚卵于普通飼養(yǎng)用水正常發(fā)育 10 h，之后將其置于細胞培養(yǎng)板中進行染毒實驗。在倒置顯微鏡下觀察0 hpf 組魚卵4 h 的卵凝結(jié)情況，之后與10 hpf 組實

8、驗魚卵一起觀察12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 時的發(fā)育變化與毒理學(xué)終點，并統(tǒng)計各實驗組的斑馬魚胚胎的死亡數(shù)與死亡方式、孵化數(shù)以及各項毒理學(xué)指標。1 4 數(shù)據(jù)處理計算得出各濃度下成魚的死亡率和魚卵出現(xiàn)的不同毒理學(xué)終點的概率，通過 PASW STATISTICS 18按照概率單位法計算成魚的半致死濃度( LC50) 、胚胎各毒理學(xué)終點的半致死濃度( LC50) 和半效應(yīng)濃度( EC50) ，并統(tǒng)計 36 h 各染毒組魚卵胚胎心跳次數(shù)，按照單因素方差分析( ANOVA) 比較暴露組與對照組間的顯著性差異，p 0 05 被認為差異顯著，p 0 01被認為差異極顯著。2、 結(jié)果( Re

9、sults)2 1 芴對斑馬魚成魚的半數(shù)致死濃度在染毒實驗中，斑馬魚隨染毒濃度不同出現(xiàn)不同程度中毒癥狀: 初入不同濃度的染毒溶液，斑馬魚均潛入水底，且活動遲緩，呈現(xiàn)麻痹狀態(tài)，且當對燒杯壁進行敲打時，斑馬魚反應(yīng)速度明顯變得遲鈍。隨染毒時間的增加，較低濃度組( 1 52、2 30 mg·L-1)成魚逐漸恢復(fù)活力，基本可以正常游動，而高濃度組( 5 30、8 07 mg·L-1) 成魚的呼吸變得極為急促，失去水中平衡能力，出現(xiàn)側(cè)翻側(cè)泳現(xiàn)象，部分魚類在水中呈現(xiàn)與地面垂直直立狀，并逐漸抽搐而死( 見圖1a) 。死亡魚體鰓部及心臟部明顯紅腫，且魚體脫色嚴重，幾近白色，高濃度組(

10、 8 07mg·L-1) 魚體脊椎反向彎曲嚴重( 見圖 1b) 。成魚各時間段 LC50見表 1，LC50值隨染毒時間增加，緩慢降低，表明 96 h 內(nèi)暴露時間越長，芴的毒性愈明顯，這說明芴對生物體的毒性大小受暴露時間影響。芴對成年斑馬魚的 96 h-LC50約為 3 6 mg·L-1。根據(jù) GB/T 212812007 的標準，芴對成年斑馬魚的96 h-LC50在1 10 mg·L-1之間，其毒性為急性類標準。2 2 芴對不同染毒時間的斑馬魚胚胎半數(shù)致死濃度的比較斑馬魚胚胎前 12 h 主要死亡方式為卵凝結(jié)( 圖1d) ，在 12 h 后部分胚胎出現(xiàn)

11、發(fā)育阻滯，之后停止發(fā)育，胚胎隨時間推移逐漸變得模糊不清，最終潰爛解體。0 hpf 與 10 hpf 這 2 組的 LC50結(jié)果見表 2，可以看出 0 hpf 組各 LC50值中，4 h-LC50最高，達到 17 08mg·L-1，72 h-LC50最低，為 5 88 mg·L-1。其余各時間段 LC50值隨染毒時間增加而降低，且在 4 h 到 12 h之間有一個較大的下降過程，之后逐漸趨于穩(wěn)定。這表明隨著染毒時間的增加，斑馬魚胚胎對芴的致死敏感性逐漸減小，在前 12 h 芴對斑馬魚胚胎死亡率變化影響較大，12 h 后死亡率趨于穩(wěn)定。10 hpf組由于在受精后 10

12、h 開始染毒，該組在 12 h( 染毒后 2 h) 觀察時并無魚卵死亡，故 12 h 時間點無值，預(yù)計此點 LC50值遠大于 24 h 的 28 89 mg·L-1。此組實驗，除高濃度組( 8、10 mg·L-1) 在 24 h 出現(xiàn)少數(shù)死亡魚卵，之后各濃度組并無魚卵繼續(xù)死亡，故 24 h、48 h、72 h 這 3 個時間點 LC50相等，均為 28 89 mg·L-1。2 3 芴對不同染毒時間的斑馬魚胚胎半數(shù)效應(yīng)濃度的比較本實驗中0 hpf 與10 hpf 這2 組觀察到的針對斑馬魚胚胎的非致死類指標包括:24 h 發(fā)育阻滯( 圖1f) 、24h

13、無主動運動、36 h 心率異常、48 h 心包囊腫( 圖 1g) 、48h 卵黃囊水腫，72 h 心包囊腫( 圖 1h) ，72 h 脊柱彎曲( 圖1i) 等。由于72 h 畸形這2 項指標成個例出現(xiàn)，不具備統(tǒng)計學(xué)價值，故主要分析其余5 項非致死類指標，各項指標發(fā)生的半效應(yīng)濃度( EC50) 見圖2。由圖 2 可以看出，0 hpf 組 36 h 心率異常為斑馬魚胚胎最敏感的指標，其 EC50為 2 15 mg·L-1，最不敏感指標為 24 h 發(fā)育阻滯，其 EC50為8 99 mg·L-1，0hpf 組各指標敏感性依次為 36 h 心率異常 48 h 心包囊腫 24

14、 h 無主動運動 48 h 卵黃囊水腫 24 h發(fā)育阻滯。10 hpf 組中，24 h 無主動運動、36 h 心率異常、48 h 心包囊腫三者 EC50值較為接近，分別為6 61、7 64、6 41 mg·L-1，3 項指標的值均遠低于24 h發(fā)育阻滯，這表明它們對芴的非致死效應(yīng)敏感性均遠高于 24 h 發(fā)育阻滯。10 hpf 組的 5 項指標的 EC50值均在不同程度上高于 0 hpf 組的所對應(yīng)指標的EC50值，這是由于 10 hpf 組染毒時間短，毒性蓄積量較小，從而 EC50值較高。但 10 hpf 組相對于 0 hpf組，各指標 EC50的增量并不呈比例關(guān)系，這一點還有

15、待進一步分析。2 4 芴對斑馬魚胚胎心率的影響各濃度下 0 hpf 和 10 hpf 組的 36 h 胚胎心率見圖 3 和圖 4。從這 2 個圖可知，相對于對照組，斑馬魚胚胎的心率經(jīng)不同濃度的芴水溶液染毒后均受到一定程度的抑制，且抑制率隨濃度增大而增大。其中，0 hpf 斑馬魚胚胎的各染毒組，1 mg·L-1與 2 mg·L-1這 2 個低濃度組與對照組無顯著性差異，5、8、10mg·L-1這 3 組與對照組差異極顯著( p 0 01) ，相對于對照組的抑制率分別達到 30 1%、41 3%、358% ，0 hpf 斑馬魚胚胎的 8 mg·

16、;L-1染毒組中，心率抑制率達峰值，繼續(xù)增加濃度不會導(dǎo)致心率抑制率增加。同時8 mg·L-1組標準偏差值最大，這是由于斑馬魚個體存在差異，對芴毒性的抵抗性不同，因此心率被抑制的程度也有所不同。10 hpf 斑馬魚胚胎的各染毒組中，1、2、5 mg·L-1這 3 組與對照組相比，心率均無顯著性差異，但1 mg·L-1組出現(xiàn)部分心率大于對照組的胚胎，這是由于較低含量的芴在胚胎體內(nèi)蓄積，引起了斑馬魚胚胎心率的應(yīng)激反應(yīng)。8 mg·L-1組與 10 mg·L-1組與對照組相比，存在顯著性差異( p 0 05) ，心率抑制率達到 12

17、6% 和 20 6% 。芴對 10hpf 組的心率影響小于對 0 hpf 組的心率影響，這可能是由于 10 hpf 組染毒時間較短，胚胎體內(nèi)芴的蓄積量要小于 0 hpf 組的緣故。3、 討論( Discussion)有機污染物毒性作用可分為麻醉型毒性和反應(yīng)型毒性 2 種。幾乎所有有機物對生物都表現(xiàn)出基本的致麻醉作用，這種麻醉作用一般被稱為基本毒性。麻醉毒性一般又分為非極性麻醉和極性麻醉2 種。非極性麻醉型化合物能夠穿透細胞膜，并破壞細胞膜的功能，從而從內(nèi)部影響細胞的正常運行。而極性麻醉型化合物通常為分子結(jié)構(gòu)中具有強失電子的氨基、羥基的芳烴化合物，其毒性一般高于基本毒性。在本研究中，成年斑馬魚在

18、不同濃度的芴溶液中均呈現(xiàn)麻痹狀態(tài)，分析芴的分子結(jié)構(gòu)，為介于2 環(huán)與 3 環(huán)間的多環(huán)芳烴，并不包含氨基、羥基等強失電子結(jié)構(gòu)的基團，因此推測芴對斑馬魚成魚的主要毒性機理為非極性麻醉。這也與 Inacardona 等推測的結(jié)果相符合，他對 3 環(huán) PAHs 菲進行深入研究，發(fā)現(xiàn)其機制是在生物膜內(nèi)大量蓄積的化合物破壞了細胞雙層脂膜的功能，并進而導(dǎo)致心臟功能的紊亂，其毒性屬于非極性麻醉效應(yīng)。這也說明介于 2環(huán)與 3 環(huán)間的 PAHs 芴與 3 環(huán) PAHs 菲的毒性相似。Charles 等將斑馬魚胚胎的發(fā)育定義為 7 個階段: 合子、卵裂、囊胚、原腸、分節(jié)、咽囊以及孵化期。分別對應(yīng)的胚胎發(fā)育時間為 0

19、h、0 75 h、2 25h、5 25 h、10 h、24 h、48 h。通過對比 0 hpf 組與 10hpf 組胚胎 LC50變化的差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過相同時間的染毒，LC50變化比例并不相同，這表明斑馬魚胚胎發(fā)育不同階段對芴的致死敏感性并不相同。同時 0 hpf組各時間點的 LC50遠小于 10 hpf 組，這也說明 0 hpf組魚卵對芴的致死敏感性遠大于 10 hpf 組，因此推斷芴對斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)主要發(fā)生在胚胎受精后的前 10 h，即分節(jié)期之前。成魚、0 hpf 組、10 hpf組斑馬魚的 48 h-LC50分別為 4 013、6 074、28 980mg·L-1?？梢钥闯鋈邔讨滤佬孕?yīng)的敏感性為成魚 斑馬魚胚胎 0 hpf 染毒 斑馬魚胚胎 10 hpf染毒。這可能是由于相較于成年斑馬魚，斑馬魚胚胎存在卵膜，其在斑馬魚體外又形成了一層屏障。故斑馬魚成魚比斑馬魚胚胎對芴的直接染毒更為敏感。而且胚胎卵膜自身也隨發(fā)育時間的增加，變得可以抵御水體中較大濃度的芴，這也可以解釋分節(jié)期前的斑馬魚胚胎對芴的致死性效應(yīng)具有更高的敏感性，而分節(jié)期后斑馬魚胚胎具有更大的耐受性。分析斑馬魚胚胎出現(xiàn)的各毒理學(xué)終點，