影響愈傷組織中次生代謝產物含量的因素影響探討

1、影響愈傷組織中次生代謝產物含量的因素影響探討植物次生代謝過程是植物在長期進化中對生態(tài)環(huán)境適應的結果，次生代謝產物雖然是植物生長非必須物質，但是，當植物在非生物脅迫條件下以及受到食草動物和病原體的攻擊時，它們起著非常重要的保護作用，間接地影響著植物的生長【1】。近年來，大量植物次生代謝產物被發(fā)現，部分已經廣泛的應用于醫(yī)藥產業(yè)，其生物學作用與功能也越來越受到科學家們的重視。藥用植物的有效成分通常都是植物次生代謝產物，其含量高低與藥材品質息息相關【4】。在植物不同的器官和組織或是不同的發(fā)育時期，次生代謝產物的產生和積累量都不同，通常在脅迫條件下才能大量積累【5】。為了有效地保護藥用植物種質資源同時確

2、保高效生產次生代謝產物，通過愈傷組織培養(yǎng)獲得次生代謝產物已被認為是一個行之有效的方法， 愈傷組織培養(yǎng)技術具有操作簡單、生長快、培養(yǎng)效率高、培養(yǎng)成本低等特點，不僅是一種植物快繁的新手段，同時也是植物改良，種質保存和有用化合物生產的理想途徑，應用前景廣闊。一些重要的次生代謝產物如燈心草吊燈花Ceropegia juncea Roxb中的吊燈花素【6】， 刺苞菜薊Cynara cardunculus L.中的洋薊素【7】， 熏衣草Lavandula angustifolia Mill.中的迷迭香酸， 金盞菊Calendula officinalis L.中的類紅蘿卜素等，都是通過體外愈傷組織培養(yǎng)獲得

3、的，利用此種方法能避免氣候、季節(jié)和地理因素等帶來的影響。但是，次生代謝產物的合成與積累受多種因素影響，為達到應用的目的，需優(yōu)化各影響因素。本文就環(huán)境、愈傷組織自身、植物生長調節(jié)劑、誘導子對愈傷組織中次生代謝產物積累的影響進行綜述，旨為提高藥用植物愈傷組織中次生代謝產物的含量提供參考。1 環(huán)境因素1.1 光照對愈傷組織中次生代謝產物合成的影響 光照并不是愈傷組織形成的必要條件。但是，在愈傷組織分化、次生代謝產物合成方面卻是重要影響因素。光照條件不同，愈傷組織的生長分化、次生代謝產物的累積有顯著差異，光照周期和光照強度是光照影響愈傷組織中次生代謝產物累積的主要因素。增加光照時間或光照強度能提高花青

4、素類或黃酮類物質的含量。狹葉竹節(jié)參Panax sikkimensis Ban愈傷組織中花青素的積累與光照時間有直接關系，24 h連續(xù)光照時，花青素的積累量在50 d時達到峰值，為6.928%，而16 h光照，8 h黑暗條件下，花青素的積累量在60 d時達到峰值，為4.025%，值得注意的是連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)，花青素積累量減少512倍，峰值時質量分數僅為1.15%。增加光照強度和延長光照周期，都能提高補骨脂Psoralea corylifolia L.愈傷組織中異黃酮的含量；縮短光照周期，異黃酮合成量明顯降低。減少光照時間或降低光照強度有利于香豆素、生物堿等次生代謝產物的合成與積累。如朱砂根Ar

5、disia crenata Sims愈傷組織中巖白菜素的含量隨著光照強度的增強而減小，當光照強度為100 lx（遮光狀態(tài)）時，巖白菜素的含量達到最高，質量分數為0.016 9%，是光照強度為5 000 lx時巖白菜素最低質量分數0.001 4%的12.07倍；分別在光照和黑暗條件中培養(yǎng)粉防己Stephania tetrandra S. Moore愈傷組織，45 d后，防己諾林堿在黑暗條件下的積累量是在冷白熒光燈照射下的2倍；而漢防己甲素只有在完全黑暗的培養(yǎng)條件下才能檢測到。個別植物在光照和黑暗條件下分別積累不同的物質。 環(huán)草石斛Dendrobii loddigesii Rolfe愈傷組織在黑暗

6、條件下有利于生物堿的合成，而光照條件則有利于多糖的積累。因此，在生產實踐中，要根據目的產物的不同， 及時調整光照強度和光照周期，以期獲得最高的產量。1.2 溫度對愈傷組織中次生代謝產物合成的影響 溫度可以直接影響細胞的生長與分化，從而影響愈傷組織的生長及代謝。愈傷組織中不同次生代謝產物的積累，需要不同的溫度條件，而其與最適生長溫度往往不同。低溫有利于生物堿的積累，而高溫有利于黃酮類物質積累。溫度對醉蝶花Cleome spinosa L.愈傷組織中花青素積累有明顯調節(jié)作用，調節(jié)溫度范圍（24±2）（32±2） ，溫度較高時花青素的積累量很小，降低溫度，花青素的積累量逐

7、漸增加，到（24±2） 時，花青素的含量達到峰值。同樣，在1638 ，玫瑰茄Hibiscus sabdariffa L.愈傷組織中總生物堿的含量隨著溫度的降低而升高，在16 時， 總生物堿含量是27 時總生物堿含量的12倍，而38 時，總生物堿的含量出現急劇下降，和16 相比，減少76倍。而李波等研究發(fā)現，在20，25，30，35 下分別培養(yǎng)紫花苜蓿Medicago sativa L.愈傷組織，愈傷組織中異黃酮的積累量分別是0.278%，0.497%，0.570%，0.246%，30 時異黃酮的含量最高，另外，35 下褐變后的愈傷組織中的異黃酮含量遠大于35 正常培養(yǎng)的愈傷組織中

8、異黃酮的含量， 是它的2.6倍， 表明褐變可能促進異黃酮的合成，原因尚不清楚。1.3 pH對愈傷組織中次生代謝產物合成的影響 近幾年來的研究發(fā)現，東革阿里Eurycoma longifolia Jack愈傷組織中9-methoxycanthin-6-one積累的最適pH為5.5，大于或小于5.5，其生成量都減小，推斷原因可能與東革阿里的適生環(huán)境為酸性土壤有關。小葉毛果蕓香Pilocarpus microphyllus Stapf愈傷組織中毛果蕓香堿積累的最適pH為6.8，此時毛果蕓香堿積累量增長最快。然而，有些藥用植物的愈傷組織對pH不敏感，改變天胡荽屬藥用植物銅錢草Hydrocotyle b

9、onariensis L.培養(yǎng)基的pH，愈傷組織中類黃酮的含量沒有明顯變化。所以在進行提高次生代謝產物含量研究時，要考慮原植物適生環(huán)境的酸堿度。除上述因素外，影響愈傷組織生長和次生代謝產物積累的環(huán)境因素還有很多，比如溶氧、通氣等。因此，要想獲得更大量的目標次生代謝產物，必須尋找最合適環(huán)境條件。2 自身因素2.1 不同外植體對愈傷組織中次生代謝產物合成的影響 藥用植物的不同品種或同種不同部位的外植體，如葉、花、莖、成熟胚、芽等經過組織培養(yǎng)誘導出的愈傷組織含有的次生代謝產物的含量有明顯差別，因此，要提高次生代謝產物的生成量，選擇合適的外植體非常關鍵。實驗證明，印度楝Azadirachta indi

10、ca A.Juss愈傷組織培養(yǎng)過程中， 外植體取材部位不同， 誘導率不同， 積累的川楝素含量也不同，其中未成熟的花積累的川楝素含量最高， 其次是結節(jié)性的莖切片、未成熟胚、葉，未成熟的種子積累川楝素的量最小。Mischenko等選用茜草Rubia cordifolia L.的葉、葉柄、莖、莖尖誘導為愈傷組織檢測蒽醌的累積量，結果顯示，相比來源于莖尖和葉的愈傷組織，從葉柄和莖誘導而來的愈傷組織中蒽醌的含量較高。意大利藍薊Echium italicum L.的愈傷組織產生的紫草素類似物，能夠使愈傷組織顯色，顯色越深，表明紫草素類似物含量越多，用子葉、下胚軸、根3種外植體誘導愈傷組織，發(fā)現，來源于根的

11、愈傷組織，顯色最深，因此推測用根誘導的愈傷組織內有效成分的含量最多。從以上實例可以看出，選用適合的外植體誘導愈傷組織，可以更為高效的獲得次生代謝產物。但究竟選擇何種外植體較為合適， 通過以上分析，可以發(fā)現，原植物中含量較高的部位或者入藥的部位誘導出的愈傷組織容易產生較高含量的次生代謝物。2.2 不同種質對愈傷組織中次生代謝產物合成的影響 一種中藥往往來源于多種基原植物，不同種的基原植物，其生理生化功能具有明顯差異。如某基原植物中某種特定次生代謝產物含量較高，則愈傷組織中一般也能合成較多的此種次生代謝產物。例如，齒瓣延胡索Corydalis turtschaninovii Besser和東北延胡

12、索C. ambigua Cham.et Sch.愈傷組織中延胡索乙素的積累情況不同，齒瓣延胡索愈傷組織中含有延胡索乙素，而東北延胡索愈傷組織中未檢測到延胡索乙素。就延胡索藥材來說，齒瓣延胡索曾是明朝以前的正品延胡索，其藥效優(yōu)于東北延胡索，實驗研究也證明東北延胡索藥材中延胡索乙素的含量甚微。Yew Lee等比較桑屬的2種植物Morus alba L. 和M. bombycis K.的葉、莖、根作為外植體培育愈傷組織中蘆丁的積累量，結果表明，2種植物愈傷組織均能產生一定量的蘆丁，M. alba 愈傷組織中蘆丁的含量是M. bombycis 愈傷組織中蘆丁含量的6倍， 并且都以根誘導形成的愈傷組織中

13、蘆丁含量最高。不同紅豆杉愈傷組織中紫杉醇含量差異很大，云南紅豆杉Taxus yunnanensis Cheng et L. k. Fu愈傷組織中紫杉醇的含量顯著高于其他種，與紅豆杉植株中的含量高低順序相似。所以在以次生代謝物為培養(yǎng)目的的研究中，應選用優(yōu)良的種質資源作為外植體來源。3 植物生長調節(jié)劑植物生長調節(jié)劑對藥用植物有較強的生理和生物學效應，具有調節(jié)細胞生長及分化等功能。植物生長素和細胞分裂素是植物組織培養(yǎng)中應用最廣泛的植物生長調節(jié)劑，常用的生長素有2， 4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等；常用的細胞分裂素有激動素（KT）、6-芐基腺

14、嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑（TDZ）等。不同類型的植物生長調節(jié)劑誘導作用不同，為了能更多積累次生代謝產物，通常把生長素和激動素配合使用。已有研究表明，細胞分裂素在誘導愈傷組織形成的過程中，通常都要和植物生長素聯(lián)合使用，促進愈傷組織的生長、增殖和分化， 二者聯(lián)合使用也能促進愈傷組織中次生代謝產物的合成與積累。研究發(fā)現，添加0.05 mg-L-1 KT+0.2 mg-L-1 2，4-D的1/2MS培養(yǎng)基是五味子Schisandra chinensis Baillon愈傷組織中木質素產生的最佳條件，在這種條件下，gomisin A的含量占愈傷組織

15、干重的0.05%，gomisin F占0.04%。而沙棗Elaeagnus angustifolia L.愈傷組織中縮合鞣質積累的最佳激素組合是0.1 mg-L-1 TDZ+0.1 mg-L-1 6-BA。相同的激素類型，不同濃度，對愈傷組織中次生代謝產物積累的影響也是不同的，2.0 mg-L-1 2，4-D+1.0 mg-L-1 KT最適合半夏Pinellia ternata （Thunb.） Breit.愈傷組織中生物堿的積累，其次是0.2 mg-L-1 2，4-D+2.0 mg-L-1 6-BA，積累生物堿最少的是添加了激素組合為0.5 mg-L-1 2，4-D+1.0 mg-L-1 K

16、T的培養(yǎng)基。但是，有些藥用植物種類使用一種生長調節(jié)劑就能顯著促進細胞次生代謝產物的合成與積累，在粉防已S. tetrandra愈傷組織中加入不同的植物生長調節(jié)劑后發(fā)現，在添加了植物生長素的愈傷組織中沒有檢測到防己諾林堿和漢防己甲素，而添加細胞分裂素的愈傷組織中則能檢測到這2種物質，最適合愈傷組織生長和產物積累的激素是6-BA和TDZ。生長調節(jié)劑對桑M. alba 愈傷組織生長及蘆丁含量有較大影響，在培養(yǎng)基中加入IAA，2，4-D，NAA等植物生長素，不僅能夠促進桑愈傷組織的發(fā)育，還能提高蘆丁的含量；但是，當加入細胞分裂素類調節(jié)劑6-BA和KT時，不僅抑制愈傷組織的生長，而且影響蘆丁的合成。4

17、誘導子誘導子是一類特殊的活性物質，它能夠通過快速、專一和選擇性的誘導植物特定基因的表達而促進細胞合成和特定代謝產物的積累，具有較強的特異性。誘導子常分為生物誘導子和非生物誘導子。生物誘導子包括真菌、細菌等微生物及其提取物，如甘露醇、多糖類、茉莉酸、脫落酸等；非生物誘導子有紫外線、高溫、低溫、pH、乙烯、重金屬鹽和高濃度鹽等。目前，在提高植物次生代謝產物積累方面應用最廣泛的是生物誘導子中的真菌誘導子。真菌的菌體、菌體的降解產物、菌體細胞內成分、菌體分泌物等均可作為誘導子使用。比如，在虎杖Reynoutria japonica Houtt. 愈傷組織中加入黑曲霉粗提物，白藜蘆醇的含量明顯增加。甘露

18、醇、多糖類、茉莉酸、脫落酸等誘導子在植物次生代謝產物積累方面也較為常用，如在葡萄Vitis vinifera L.愈傷組織的培養(yǎng)基中加入364 μmg-L-1甘露醇和8.4 μmg-L-1茉莉酸，愈傷組織中反式白藜蘆醇的生物合成量明顯增加。同樣適量的甲基茉莉酮（4.5 mg- L-1）、水楊酸鈉（10 mg-L-1）、抗壞血酸（10 mg-L-1），殼聚糖（20 mg-L-1或50 mg- L-1）均對鴨嘴花Adhatoda vasica L.愈傷組織中鴨嘴花堿的積累有促進作用。關于生物誘導子促進次生代謝物含量提高的機制，認為與信號傳導、基因表達有關。真菌誘導子能與植物細胞表面的特

19、殊誘導位點結合，誘導子被識別后細胞膜去極化，通過離子通道開閉或G蛋白偶聯(lián)激活第二信使，將胞外的信號跨膜傳遞到胞內，一方面引起核內基因表達的變化，從而影響相關蛋白基因的表達，促進次生代謝產物的積累；另一方面通過誘導新酶的合成或是提高代謝途徑中關鍵酶的量來調控次生代謝產物的合成?；⒄扔鷤M織中黑曲霉誘導白藜蘆醇增加是通過苯丙烷類生物合成途徑完成的，過程中苯丙氨酸裂解酶（PAL）、二苯乙烯合酶（STS）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸CoA連接酶（4CH）等一系列相關酶起著重要作用，黑曲霉粗多糖、殼聚糖作用于虎杖細胞使其產生過氧化氫，激活防御基因，從而使相關酶活性增強，次生代謝產物合成增加

20、。非生物誘導子紫外線同樣能促進植物愈傷組織次生代謝產物的合成積累。Shilpa Ramani研究發(fā)現，經紫外線照射的長春花Catharanthus roseus L. G. Don愈傷組織和未經照射的對照組相比，長春花堿的含量增長了3倍，vindoline含量增加12倍。適當的紫外光照射有利于何首烏Polygonum multiflorum Thunb. 愈傷組織中二苯乙烯苷含量的增長。甚至有些成分只有經過紫外照射后才能產生，比如，大豆黃酮、鷹嘴豆素A、芒柄花黃素只有在紫外照射過的染料木Genista tinctoria L.愈傷組織中才能檢測到。紫外光可作為誘導子應用，短時間輻照后就可大幅度

21、提高多種次生代謝產物的含量。不同波段、不同波長的紫外輻照對愈傷組織的生長和次生代謝產物的積累也有不同的影響，常用的紫外光是UV-A和UV-C。用UV-A光（365 nm）照射雪地衣藻的愈傷組織后，酚類化合物含量增長了5%12%，而改為UV-C光（254 nm）照射后，酚類化合物含量增長12%24%。染料木Genista tinctoria L.愈傷組織中異黃酮的含量隨紫外照射波長的改變而變化：當紫外波長為360 nm時，染料木苷質量分數的峰值為20.6 mg-g -1，而當紫外波長為254 nm時，染料木苷的含量達到最大，為30.3 mg-g -1；在波長為366 nm的紫外光照射下，其他種類

22、異黃酮如黃豆苷元和芒柄花黃素的含量均能達到峰值，質量分數分別是0.5，0.7 mg-g-1。5 營養(yǎng)因子不同含量和不同組合的營養(yǎng)因子對愈傷組織中次生代謝產物的積累有很大的影響。研究較多的營養(yǎng)因子包括基本培養(yǎng)基、碳源、氮源等。不同基本培養(yǎng)基由于無機鹽濃度和元素間比例不同，對愈傷組織細胞的代謝有顯著影響。常用的碳源是蔗糖，但果糖、半乳糖等對有些藥用植物有明顯提高次生代謝產物含量的作用。硝酸鹽，銨鹽的適宜比例對次生代謝產物的合成與積累影響也較大。因此， 在進行植物愈傷組織培養(yǎng)時， 選用合適的營養(yǎng)成分比例， 不僅會提高胚性愈傷組織的誘導率， 改善愈傷組織的質量， 而且有利于愈傷組織中次生代謝產物的累積

23、。對于營養(yǎng)因子的影響，已有較多文獻做過詳細介紹，不再贅述。6 展望影響愈傷組織中次生代謝產物積累的因素很多，只有找到最適宜的培養(yǎng)條件，才能使愈傷組織合成更多的目標產物，達到含量提高的目的。對于一種新的藥用植物，一般要經過以下幾個途徑來定向提高目標次生代謝產物含量：種質選擇適宜外植體選取設定最適環(huán)境條件-合適的營養(yǎng)成分比例添加有效的植物生長調節(jié)劑應用誘導子。其中，合適的營養(yǎng)成分比例是愈傷組織生長、次生代謝產物積累的基礎，環(huán)境因素影響次生代謝產物的積累量，有效的植物生長激素和誘導子，可以促使目標產物更快速、更高產高效的積累。目前，從愈傷組織中獲得有用次生代謝產物的方法仍停留在實驗階段，還有很多技術

24、問題需要深入研究。相信隨著對愈傷組織積累次生代謝物條件及機制研究的深入，該項技術必將應用于醫(yī)藥工業(yè)產業(yè)化生產?！?】 Wu J Y， Wong K， Ho K P， et al. Enhancement of saponin production in Panax ginsengcell culture by osmotic stress and nutrient feeding. Enzyme Microb Technol， 2005， 36（1）： 133.【2】 高麗君， 崔建華， 劉風云， 等. 植物次生代謝物的應用和開發(fā). 生物學通報， 2004， 39（7）： 15.【3】 段傳人

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