影響愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物含量的因素影響探討

1、影響愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物含量的因素影響探討植物次生代謝過程是植物在長期進(jìn)化中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，次生代謝產(chǎn)物雖然是植物生長非必須物質(zhì)，但是，當(dāng)植物在非生物脅迫條件下以及受到食草動物和病原體的攻擊時，它們起著非常重要的保護(hù)作用，間接地影響著植物的生長【1】。近年來，大量植物次生代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，部分已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，其生物學(xué)作用與功能也越來越受到科學(xué)家們的重視。藥用植物的有效成分通常都是植物次生代謝產(chǎn)物，其含量高低與藥材品質(zhì)息息相關(guān)【4】。在植物不同的器官和組織或是不同的發(fā)育時期，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累量都不同，通常在脅迫條件下才能大量積累【5】。為了有效地保護(hù)藥用植物種質(zhì)資源同時確

2、保高效生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，通過愈傷組織培養(yǎng)獲得次生代謝產(chǎn)物已被認(rèn)為是一個行之有效的方法， 愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)具有操作簡單、生長快、培養(yǎng)效率高、培養(yǎng)成本低等特點，不僅是一種植物快繁的新手段，同時也是植物改良，種質(zhì)保存和有用化合物生產(chǎn)的理想途徑，應(yīng)用前景廣闊。一些重要的次生代謝產(chǎn)物如燈心草吊燈花Ceropegia juncea Roxb中的吊燈花素【6】， 刺苞菜薊Cynara cardunculus L.中的洋薊素【7】， 熏衣草Lavandula angustifolia Mill.中的迷迭香酸， 金盞菊Calendula officinalis L.中的類紅蘿卜素等，都是通過體外愈傷組織培養(yǎng)獲得

3、的，利用此種方法能避免氣候、季節(jié)和地理因素等帶來的影響。但是，次生代謝產(chǎn)物的合成與積累受多種因素影響，為達(dá)到應(yīng)用的目的，需優(yōu)化各影響因素。本文就環(huán)境、愈傷組織自身、植物生長調(diào)節(jié)劑、誘導(dǎo)子對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累的影響進(jìn)行綜述，旨為提高藥用植物愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的含量提供參考。1 環(huán)境因素1.1 光照對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物合成的影響 光照并不是愈傷組織形成的必要條件。但是，在愈傷組織分化、次生代謝產(chǎn)物合成方面卻是重要影響因素。光照條件不同，愈傷組織的生長分化、次生代謝產(chǎn)物的累積有顯著差異，光照周期和光照強度是光照影響愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物累積的主要因素。增加光照時間或光照強度能提高花青

4、素類或黃酮類物質(zhì)的含量。狹葉竹節(jié)參Panax sikkimensis Ban愈傷組織中花青素的積累與光照時間有直接關(guān)系，24 h連續(xù)光照時，花青素的積累量在50 d時達(dá)到峰值，為6.928%，而16 h光照，8 h黑暗條件下，花青素的積累量在60 d時達(dá)到峰值，為4.025%，值得注意的是連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)，花青素積累量減少512倍，峰值時質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為1.15%。增加光照強度和延長光照周期，都能提高補骨脂Psoralea corylifolia L.愈傷組織中異黃酮的含量；縮短光照周期，異黃酮合成量明顯降低。減少光照時間或降低光照強度有利于香豆素、生物堿等次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。如朱砂根Ar

5、disia crenata Sims愈傷組織中巖白菜素的含量隨著光照強度的增強而減小，當(dāng)光照強度為100 lx（遮光狀態(tài)）時，巖白菜素的含量達(dá)到最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.016 9%，是光照強度為5 000 lx時巖白菜素最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001 4%的12.07倍；分別在光照和黑暗條件中培養(yǎng)粉防己Stephania tetrandra S. Moore愈傷組織，45 d后，防己諾林堿在黑暗條件下的積累量是在冷白熒光燈照射下的2倍；而漢防己甲素只有在完全黑暗的培養(yǎng)條件下才能檢測到。個別植物在光照和黑暗條件下分別積累不同的物質(zhì)。 環(huán)草石斛Dendrobii loddigesii Rolfe愈傷組織在黑暗

6、條件下有利于生物堿的合成，而光照條件則有利于多糖的積累。因此，在生產(chǎn)實踐中，要根據(jù)目的產(chǎn)物的不同， 及時調(diào)整光照強度和光照周期，以期獲得最高的產(chǎn)量。1.2 溫度對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物合成的影響 溫度可以直接影響細(xì)胞的生長與分化，從而影響愈傷組織的生長及代謝。愈傷組織中不同次生代謝產(chǎn)物的積累，需要不同的溫度條件，而其與最適生長溫度往往不同。低溫有利于生物堿的積累，而高溫有利于黃酮類物質(zhì)積累。溫度對醉蝶花Cleome spinosa L.愈傷組織中花青素積累有明顯調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)溫度范圍（24±2）（32±2） ，溫度較高時花青素的積累量很小，降低溫度，花青素的積累量逐

7、漸增加，到（24±2） 時，花青素的含量達(dá)到峰值。同樣，在1638 ，玫瑰茄Hibiscus sabdariffa L.愈傷組織中總生物堿的含量隨著溫度的降低而升高，在16 時， 總生物堿含量是27 時總生物堿含量的12倍，而38 時，總生物堿的含量出現(xiàn)急劇下降，和16 相比，減少76倍。而李波等研究發(fā)現(xiàn)，在20，25，30，35 下分別培養(yǎng)紫花苜蓿Medicago sativa L.愈傷組織，愈傷組織中異黃酮的積累量分別是0.278%，0.497%，0.570%，0.246%，30 時異黃酮的含量最高，另外，35 下褐變后的愈傷組織中的異黃酮含量遠(yuǎn)大于35 正常培養(yǎng)的愈傷組織中

8、異黃酮的含量， 是它的2.6倍， 表明褐變可能促進(jìn)異黃酮的合成，原因尚不清楚。1.3 pH對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物合成的影響 近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)，東革阿里Eurycoma longifolia Jack愈傷組織中9-methoxycanthin-6-one積累的最適pH為5.5，大于或小于5.5，其生成量都減小，推斷原因可能與東革阿里的適生環(huán)境為酸性土壤有關(guān)。小葉毛果蕓香Pilocarpus microphyllus Stapf愈傷組織中毛果蕓香堿積累的最適pH為6.8，此時毛果蕓香堿積累量增長最快。然而，有些藥用植物的愈傷組織對pH不敏感，改變天胡荽屬藥用植物銅錢草Hydrocotyle b

9、onariensis L.培養(yǎng)基的pH，愈傷組織中類黃酮的含量沒有明顯變化。所以在進(jìn)行提高次生代謝產(chǎn)物含量研究時，要考慮原植物適生環(huán)境的酸堿度。除上述因素外，影響愈傷組織生長和次生代謝產(chǎn)物積累的環(huán)境因素還有很多，比如溶氧、通氣等。因此，要想獲得更大量的目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物，必須尋找最合適環(huán)境條件。2 自身因素2.1 不同外植體對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物合成的影響 藥用植物的不同品種或同種不同部位的外植體，如葉、花、莖、成熟胚、芽等經(jīng)過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出的愈傷組織含有的次生代謝產(chǎn)物的含量有明顯差別，因此，要提高次生代謝產(chǎn)物的生成量，選擇合適的外植體非常關(guān)鍵。實驗證明，印度楝Azadirachta indi

10、ca A.Juss愈傷組織培養(yǎng)過程中， 外植體取材部位不同， 誘導(dǎo)率不同， 積累的川楝素含量也不同，其中未成熟的花積累的川楝素含量最高， 其次是結(jié)節(jié)性的莖切片、未成熟胚、葉，未成熟的種子積累川楝素的量最小。Mischenko等選用茜草Rubia cordifolia L.的葉、葉柄、莖、莖尖誘導(dǎo)為愈傷組織檢測蒽醌的累積量，結(jié)果顯示，相比來源于莖尖和葉的愈傷組織，從葉柄和莖誘導(dǎo)而來的愈傷組織中蒽醌的含量較高。意大利藍(lán)薊Echium italicum L.的愈傷組織產(chǎn)生的紫草素類似物，能夠使愈傷組織顯色，顯色越深，表明紫草素類似物含量越多，用子葉、下胚軸、根3種外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)，來源于根的

11、愈傷組織，顯色最深，因此推測用根誘導(dǎo)的愈傷組織內(nèi)有效成分的含量最多。從以上實例可以看出，選用適合的外植體誘導(dǎo)愈傷組織，可以更為高效的獲得次生代謝產(chǎn)物。但究竟選擇何種外植體較為合適， 通過以上分析，可以發(fā)現(xiàn)，原植物中含量較高的部位或者入藥的部位誘導(dǎo)出的愈傷組織容易產(chǎn)生較高含量的次生代謝物。2.2 不同種質(zhì)對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物合成的影響 一種中藥往往來源于多種基原植物，不同種的基原植物，其生理生化功能具有明顯差異。如某基原植物中某種特定次生代謝產(chǎn)物含量較高，則愈傷組織中一般也能合成較多的此種次生代謝產(chǎn)物。例如，齒瓣延胡索Corydalis turtschaninovii Besser和東北延胡

12、索C. ambigua Cham.et Sch.愈傷組織中延胡索乙素的積累情況不同，齒瓣延胡索愈傷組織中含有延胡索乙素，而東北延胡索愈傷組織中未檢測到延胡索乙素。就延胡索藥材來說，齒瓣延胡索曾是明朝以前的正品延胡索，其藥效優(yōu)于東北延胡索，實驗研究也證明東北延胡索藥材中延胡索乙素的含量甚微。Yew Lee等比較桑屬的2種植物Morus alba L. 和M. bombycis K.的葉、莖、根作為外植體培育愈傷組織中蘆丁的積累量，結(jié)果表明，2種植物愈傷組織均能產(chǎn)生一定量的蘆丁，M. alba 愈傷組織中蘆丁的含量是M. bombycis 愈傷組織中蘆丁含量的6倍， 并且都以根誘導(dǎo)形成的愈傷組織中

13、蘆丁含量最高。不同紅豆杉愈傷組織中紫杉醇含量差異很大，云南紅豆杉Taxus yunnanensis Cheng et L. k. Fu愈傷組織中紫杉醇的含量顯著高于其他種，與紅豆杉植株中的含量高低順序相似。所以在以次生代謝物為培養(yǎng)目的的研究中，應(yīng)選用優(yōu)良的種質(zhì)資源作為外植體來源。3 植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長調(diào)節(jié)劑對藥用植物有較強的生理和生物學(xué)效應(yīng)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分化等功能。植物生長素和細(xì)胞分裂素是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛的植物生長調(diào)節(jié)劑，常用的生長素有2， 4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等；常用的細(xì)胞分裂素有激動素（KT）、6-芐基腺

14、嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑（TDZ）等。不同類型的植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)作用不同，為了能更多積累次生代謝產(chǎn)物，通常把生長素和激動素配合使用。已有研究表明，細(xì)胞分裂素在誘導(dǎo)愈傷組織形成的過程中，通常都要和植物生長素聯(lián)合使用，促進(jìn)愈傷組織的生長、增殖和分化， 二者聯(lián)合使用也能促進(jìn)愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。研究發(fā)現(xiàn)，添加0.05 mg-L-1 KT+0.2 mg-L-1 2，4-D的1/2MS培養(yǎng)基是五味子Schisandra chinensis Baillon愈傷組織中木質(zhì)素產(chǎn)生的最佳條件，在這種條件下，gomisin A的含量占愈傷組織

15、干重的0.05%，gomisin F占0.04%。而沙棗Elaeagnus angustifolia L.愈傷組織中縮合鞣質(zhì)積累的最佳激素組合是0.1 mg-L-1 TDZ+0.1 mg-L-1 6-BA。相同的激素類型，不同濃度，對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累的影響也是不同的，2.0 mg-L-1 2，4-D+1.0 mg-L-1 KT最適合半夏Pinellia ternata （Thunb.） Breit.愈傷組織中生物堿的積累，其次是0.2 mg-L-1 2，4-D+2.0 mg-L-1 6-BA，積累生物堿最少的是添加了激素組合為0.5 mg-L-1 2，4-D+1.0 mg-L-1 K

16、T的培養(yǎng)基。但是，有些藥用植物種類使用一種生長調(diào)節(jié)劑就能顯著促進(jìn)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成與積累，在粉防已S. tetrandra愈傷組織中加入不同的植物生長調(diào)節(jié)劑后發(fā)現(xiàn)，在添加了植物生長素的愈傷組織中沒有檢測到防己諾林堿和漢防己甲素，而添加細(xì)胞分裂素的愈傷組織中則能檢測到這2種物質(zhì)，最適合愈傷組織生長和產(chǎn)物積累的激素是6-BA和TDZ。生長調(diào)節(jié)劑對桑M. alba 愈傷組織生長及蘆丁含量有較大影響，在培養(yǎng)基中加入IAA，2，4-D，NAA等植物生長素，不僅能夠促進(jìn)桑愈傷組織的發(fā)育，還能提高蘆丁的含量；但是，當(dāng)加入細(xì)胞分裂素類調(diào)節(jié)劑6-BA和KT時，不僅抑制愈傷組織的生長，而且影響蘆丁的合成。4

17、誘導(dǎo)子誘導(dǎo)子是一類特殊的活性物質(zhì)，它能夠通過快速、專一和選擇性的誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞合成和特定代謝產(chǎn)物的積累，具有較強的特異性。誘導(dǎo)子常分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子包括真菌、細(xì)菌等微生物及其提取物，如甘露醇、多糖類、茉莉酸、脫落酸等；非生物誘導(dǎo)子有紫外線、高溫、低溫、pH、乙烯、重金屬鹽和高濃度鹽等。目前，在提高植物次生代謝產(chǎn)物積累方面應(yīng)用最廣泛的是生物誘導(dǎo)子中的真菌誘導(dǎo)子。真菌的菌體、菌體的降解產(chǎn)物、菌體細(xì)胞內(nèi)成分、菌體分泌物等均可作為誘導(dǎo)子使用。比如，在虎杖Reynoutria japonica Houtt. 愈傷組織中加入黑曲霉粗提物，白藜蘆醇的含量明顯增加。甘露

18、醇、多糖類、茉莉酸、脫落酸等誘導(dǎo)子在植物次生代謝產(chǎn)物積累方面也較為常用，如在葡萄Vitis vinifera L.愈傷組織的培養(yǎng)基中加入364 μmg-L-1甘露醇和8.4 μmg-L-1茉莉酸，愈傷組織中反式白藜蘆醇的生物合成量明顯增加。同樣適量的甲基茉莉酮（4.5 mg- L-1）、水楊酸鈉（10 mg-L-1）、抗壞血酸（10 mg-L-1），殼聚糖（20 mg-L-1或50 mg- L-1）均對鴨嘴花Adhatoda vasica L.愈傷組織中鴨嘴花堿的積累有促進(jìn)作用。關(guān)于生物誘導(dǎo)子促進(jìn)次生代謝物含量提高的機制，認(rèn)為與信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)有關(guān)。真菌誘導(dǎo)子能與植物細(xì)胞表面的特

19、殊誘導(dǎo)位點結(jié)合，誘導(dǎo)子被識別后細(xì)胞膜去極化，通過離子通道開閉或G蛋白偶聯(lián)激活第二信使，將胞外的信號跨膜傳遞到胞內(nèi)，一方面引起核內(nèi)基因表達(dá)的變化，從而影響相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累；另一方面通過誘導(dǎo)新酶的合成或是提高代謝途徑中關(guān)鍵酶的量來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成。虎杖愈傷組織中黑曲霉誘導(dǎo)白藜蘆醇增加是通過苯丙烷類生物合成途徑完成的，過程中苯丙氨酸裂解酶（PAL）、二苯乙烯合酶（STS）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸CoA連接酶（4CH）等一系列相關(guān)酶起著重要作用，黑曲霉粗多糖、殼聚糖作用于虎杖細(xì)胞使其產(chǎn)生過氧化氫，激活防御基因，從而使相關(guān)酶活性增強，次生代謝產(chǎn)物合成增加

20、。非生物誘導(dǎo)子紫外線同樣能促進(jìn)植物愈傷組織次生代謝產(chǎn)物的合成積累。Shilpa Ramani研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外線照射的長春花Catharanthus roseus L. G. Don愈傷組織和未經(jīng)照射的對照組相比，長春花堿的含量增長了3倍，vindoline含量增加12倍。適當(dāng)?shù)淖贤夤庹丈溆欣诤问诪鮌olygonum multiflorum Thunb. 愈傷組織中二苯乙烯苷含量的增長。甚至有些成分只有經(jīng)過紫外照射后才能產(chǎn)生，比如，大豆黃酮、鷹嘴豆素A、芒柄花黃素只有在紫外照射過的染料木Genista tinctoria L.愈傷組織中才能檢測到。紫外光可作為誘導(dǎo)子應(yīng)用，短時間輻照后就可大幅度

21、提高多種次生代謝產(chǎn)物的含量。不同波段、不同波長的紫外輻照對愈傷組織的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累也有不同的影響，常用的紫外光是UV-A和UV-C。用UV-A光（365 nm）照射雪地衣藻的愈傷組織后，酚類化合物含量增長了5%12%，而改為UV-C光（254 nm）照射后，酚類化合物含量增長12%24%。染料木Genista tinctoria L.愈傷組織中異黃酮的含量隨紫外照射波長的改變而變化：當(dāng)紫外波長為360 nm時，染料木苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的峰值為20.6 mg-g -1，而當(dāng)紫外波長為254 nm時，染料木苷的含量達(dá)到最大，為30.3 mg-g -1；在波長為366 nm的紫外光照射下，其他種類

22、異黃酮如黃豆苷元和芒柄花黃素的含量均能達(dá)到峰值，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是0.5，0.7 mg-g-1。5 營養(yǎng)因子不同含量和不同組合的營養(yǎng)因子對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的積累有很大的影響。研究較多的營養(yǎng)因子包括基本培養(yǎng)基、碳源、氮源等。不同基本培養(yǎng)基由于無機鹽濃度和元素間比例不同，對愈傷組織細(xì)胞的代謝有顯著影響。常用的碳源是蔗糖，但果糖、半乳糖等對有些藥用植物有明顯提高次生代謝產(chǎn)物含量的作用。硝酸鹽，銨鹽的適宜比例對次生代謝產(chǎn)物的合成與積累影響也較大。因此， 在進(jìn)行植物愈傷組織培養(yǎng)時， 選用合適的營養(yǎng)成分比例， 不僅會提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率， 改善愈傷組織的質(zhì)量， 而且有利于愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的累積

23、。對于營養(yǎng)因子的影響，已有較多文獻(xiàn)做過詳細(xì)介紹，不再贅述。6 展望影響愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累的因素很多，只有找到最適宜的培養(yǎng)條件，才能使愈傷組織合成更多的目標(biāo)產(chǎn)物，達(dá)到含量提高的目的。對于一種新的藥用植物，一般要經(jīng)過以下幾個途徑來定向提高目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物含量：種質(zhì)選擇適宜外植體選取設(shè)定最適環(huán)境條件-合適的營養(yǎng)成分比例添加有效的植物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)用誘導(dǎo)子。其中，合適的營養(yǎng)成分比例是愈傷組織生長、次生代謝產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)，環(huán)境因素影響次生代謝產(chǎn)物的積累量，有效的植物生長激素和誘導(dǎo)子，可以促使目標(biāo)產(chǎn)物更快速、更高產(chǎn)高效的積累。目前，從愈傷組織中獲得有用次生代謝產(chǎn)物的方法仍停留在實驗階段，還有很多技術(shù)

24、問題需要深入研究。相信隨著對愈傷組織積累次生代謝物條件及機制研究的深入，該項技術(shù)必將應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)?！?】 Wu J Y， Wong K， Ho K P， et al. Enhancement of saponin production in Panax ginsengcell culture by osmotic stress and nutrient feeding. Enzyme Microb Technol， 2005， 36（1）： 133.【2】 高麗君， 崔建華， 劉風(fēng)云， 等. 植物次生代謝物的應(yīng)用和開發(fā). 生物學(xué)通報， 2004， 39（7）： 15.【3】 段傳人

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