陰離子交換色譜對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)的分離純化研究(2)

1、陰離子交換色譜對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)的分離純化研究(2)2.2.3 純化前后 DNA 四面體及三角雙錐的表征收集到的產(chǎn)物濃度較低, 且流動(dòng)相中含有高鹽,為了方便下游應(yīng)用, 我們使用 MWCO 30 kDa 的超濾管進(jìn)行超濾, 對(duì)其進(jìn)行濃縮并將 DNA 四面體置換到TM 緩沖液中. 為了盡可能減小超濾對(duì)樣品的損傷,超濾中使用的離心力不要超過(guò) 2000 g. AEC 純化前后的DNA四面體使用8% PAGE進(jìn)行表征, 電泳在冰浴條件下進(jìn)行, 電壓 80 V, 電泳時(shí)間 23 h, 電泳結(jié)束后使用GelRed染色1530 min, 用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對(duì)其成像.2.2.4 啞鈴狀 DNA 納米結(jié)構(gòu)的制備與表

2、征設(shè)計(jì)兩個(gè)互補(bǔ)的 TH20: A20-TH20 和 T20-TH20,分別經(jīng) AEC 純化, 方法用 AEC-2 程序. 定量后以 1:1等摩爾混勻, 37孵育 2 h 雜交, 對(duì)比實(shí)驗(yàn)中使用未純化的 A20-TH20 與 T20-TH20 以相同條件雜交. 雜交后的結(jié)構(gòu)使用含 1×GelRed DNA 染料的 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征, 電泳條件為冰浴, 80 V, 3 h, 電泳完畢后進(jìn)行成像.3 結(jié)果與討論3.1 AEC 純化方法的建立及產(chǎn)物的表征-TH20以 TH20 為例, 確定 AEC 分離純化的條件, 并對(duì)得到的多個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行成分鑒定. 一步退火合成的TH20, 電泳

3、表征如圖 1(B)中泳道 1 所示, 多條條帶的存在證明其中除了有目標(biāo)產(chǎn)物外, 還有多個(gè)副產(chǎn)物存在. 使用 Image J 軟件計(jì)算電泳條帶灰度值可以得出 TH20 的產(chǎn)率在 42% (條帶 1 最前端). 另外還有超過(guò)一半的錯(cuò)誤折疊結(jié)構(gòu), 大部分錯(cuò)誤折疊的結(jié)構(gòu)由于分子量太大而被堵在凝膠的上樣孔, 無(wú)法被電泳出來(lái), 這里我們命名為高聚物; 也有少部分結(jié)構(gòu)能從上樣孔泳出但距離較短, 分子量仍然比 TH20 大, 命名為低聚物.本實(shí)驗(yàn)中我們選用的陰離子交換色譜柱, 其填充物是溶劑兼容性良好的直徑13 μm無(wú)孔基底, 在其表面覆蓋有一薄層季銨(陽(yáng)離子)修飾的直徑 100 nm的樹脂, 使其含有

4、豐富的陰離子交換位點(diǎn). AEC 純化DNA 四面體主要是依據(jù)混合物中不同組分跟帶正電的固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離.DNA 分子量越大, 所攜帶的陰離子越多, DNA 四面體的合成產(chǎn)物中所攜帶的陰離子數(shù)目依次為 TH203.2 利用 AEC 純化其他 DNA 納米結(jié)構(gòu)其他 DNA 納米結(jié)構(gòu)如 TH13、TH17、TH26、TH30和 TB20, 其 PAGE 結(jié)果表明, 盡管它們的產(chǎn)率各不相同, 但仍存在較大的聚集結(jié)構(gòu)(圖 2(B), 條帶 1 為純化之前的產(chǎn)物). 采用AEC-2程序?qū)σ陨隙鄠€(gè)DNA四面體進(jìn)行分離, 色譜圖如圖2(A)所示. DNA三角雙錐由于結(jié)構(gòu)較大, 帶有的

5、陰離子偏多, 在純化時(shí)需要在更高的離子強(qiáng)度下才能出峰, 采用 AEC-3 程序進(jìn)行分離. 使用 PAGE 表征將各個(gè) DNA 納米結(jié)構(gòu)純化前后的效果進(jìn)行對(duì)比, 如圖 2(B)中條帶 2 所示, AEC 純化后的各結(jié)構(gòu)的純度大大提高, 大部分副產(chǎn)物被有效去除. 目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率從純化前的 30%65%到純化后的 90%98%, 證明 AEC 在 DNA 四面體等納米結(jié)構(gòu)的純化方面具有非常高的效率和普適性.3.3 啞鈴狀 DNA 納米結(jié)構(gòu)的制備與表征我們利用 AEC 純化后的 DNA 四面體構(gòu)建了啞鈴狀的 DNA 納米結(jié)構(gòu), 并對(duì)其產(chǎn)率和純度進(jìn)行了考察. 首先設(shè)計(jì)合成了兩種帶手臂鏈的 TH20 四面

6、體:一種在四面體的頂點(diǎn)伸出 20 個(gè) A, 命名為 A20-TH20;另一種是伸出 20 個(gè) T, 以 T20-TH20 命名. 各自退火后形成四面體, 如圖 3(b)條帶 1 和 2 所示. 由于分別引入手臂鏈 A20和 T20, 使得 DNA 四面體的產(chǎn)率進(jìn)一步降低, 條帶 1 和 2 中有大量的彌散性雜帶出現(xiàn). 直接用 A20-TH20 和 T20-TH20 來(lái)制備啞鈴狀結(jié)構(gòu), 得到的產(chǎn)物也有著非常彌散的條帶, 產(chǎn)率在 11%左右. 分別將 A20-TH20 和 T20-TH20 兩種四面體用 AEC 進(jìn)行分離純化, 色譜圖如圖 3(a)所示. 我們將純化后收集到的 A20-TH20、T

7、20-TH20 兩種四面體進(jìn)行雜交來(lái)構(gòu)建啞鈴狀 DNA 納米結(jié)構(gòu)。圖 3(b)中的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示, 經(jīng)過(guò)純化后的四面體的純度很高, 在95%左右, 其雜交后的產(chǎn)物純度也有大幅提升, 大于90%. 該數(shù)據(jù)證實(shí)在 DNA 納米結(jié)構(gòu)的制備問題上,前期對(duì)四面體的純化非常重要, 較純的 DNA 四面體可以大大提高后期自組裝結(jié)構(gòu)的產(chǎn)率.4 結(jié)論我們將 AEC 方法用于 DNA 四面體及三角雙錐的純化, 將這些 DNA 納米結(jié)構(gòu)從初始合成純度30%65%提高到 95%左右, 并且我們證明經(jīng)過(guò) AEC純化后的 DNA 四面體更有利于制備產(chǎn)率更高的DNA 四面體啞鈴狀結(jié)構(gòu). 與電泳割膠回收相比, 該方法對(duì)結(jié)構(gòu)無(wú)破壞、操作簡(jiǎn)單、回收率高、短時(shí)間內(nèi)即可純化出大量樣品. 該方法可以廣泛用于 DNA 納米結(jié)構(gòu)的分離純化, 分離過(guò)程中所使用的色譜柱、流動(dòng)相等條件可以根據(jù)待分離材料的尺寸、維度等來(lái)選擇. 由于離子交換所用的網(wǎng)孔狀介質(zhì)具有分子篩和離