PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析無(wú)、非特異、拖尾_第1頁(yè)
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1、問(wèn)題1：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú) 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer對(duì)樣品不合適 3.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解 4.反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短 對(duì)策: 1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更換Buffer或調(diào)整濃度 3.重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 4.降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間 問(wèn)題2：非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶 原因： 1.引物特異性差 2.模板或引物濃度過(guò)高 3.酶量過(guò)多 4.Mg2+濃度偏高 5.退火溫度偏低 6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多 對(duì)策： 1.重新設(shè)計(jì)

2、引物或者使用巢式PCR 2.適當(dāng)降低模板或引物濃度 3.適當(dāng)減少酶量 4.降低鎂離子濃度 5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 6.減少循環(huán)次數(shù) 問(wèn)題3：拖尾 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。 原因： 1.模板不純 2.Buffer不合適 3.退火溫度偏低 4.酶量過(guò)多 5.dNTP、Mg 2+濃度偏高 6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多 對(duì)策： 1.純化模板 2.更換Buffer 3.適當(dāng)提高退火溫度 4.適量用酶 5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度 6.減少循環(huán)次數(shù) 問(wèn)題4：假陽(yáng)性 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 原因： 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物 的交*污染 對(duì)策： 1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外； 2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管 及

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