高效液相色譜法習題答案[沐風教育]

1、第二十章 高效液相色譜法思考題和習題1 簡述高效液相色譜法和氣相色譜法的主要異同點。相同點：均為高效、高速、高選擇性的色譜方法，兼具分離和分析功能，均可以在線檢測 不同點： 分析對象及范圍流動相的選擇操作條件GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，占有機物的20%流動相為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小加溫常壓操作HPLC溶解后能制成溶液的樣品，高沸點、高分子量、難氣化、離子型的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，占有機物的80%流動相為液體或各種液體的混合。它除了起運載作用外，還可通過溶劑來控制和改進分離。室溫、高壓下進行2何謂化學鍵合相？常用的化學鍵合相有哪幾種類型？分別用于哪些液相色

2、譜法中？采用化學反應的方法將固定液鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學鍵合相。優(yōu)點是使用過程不流失，化學性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，適于作梯度淋洗。目前常用的Si-O-Si-C型鍵合相，按極性分為非極性，中等極性與極性三類。非極性鍵合相：常見如ODS鍵合相，既有分配又有吸附作用，用途非常廣泛，用于分析非極性或弱極性化合物；中等圾性鍵合相：常見的有醚基鍵合相，這種鍵合相可作正相或反相色譜的固定相，視流動相的極性而定：極性鍵合相：常用氨基、氰基鍵合相，用作正相色譜的固定相，氨基鍵合相還是分離糖類最常用的固定相。3什么叫正相色譜？什么叫反相色譜？各適用于分離哪些化合物？正相色譜法：流動相極性小于固定相極

3、性的色譜法。用于分離溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)，用于含有不同官能團物質(zhì)的分離。反相色譜法：流動相極性大于固定相極性的色譜法。用于分離非極性至中等極性的分子型化合物。4簡述反相鍵合相色譜法的分離機制。典型的反相鍵合色譜法是用非極性固定相和極性流動相組成的色譜體系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）鍵合相；流動相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色譜系統(tǒng)，用弱極性或中等極性的鍵合相和極性大于固定相的流動相組成。 反相鍵合相表面具有非極性烷基官能團，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，視覆蓋率而定。對于反相色譜的分離機制目前，保留機制還沒有一致的看法，大致有兩

4、種觀點，一種認為屬于分配色譜，另一種認為屬于吸附色譜。分配色譜的作用機制是假設混合溶劑（水十有機溶劑）中極性弱的有機溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進行分配。吸附色譜的作用機制可用疏溶劑理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的分子毛，這種分子毛有強的疏水特性。當用水與有機溶劑所組成的極性溶劑為流動相來分離有機化合物時，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑作用，將會從水中被擠出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用，其結果使組分分子在固定相得到保留。另一方面，被分離物的極性部分

5、受到極性流動相的作用，使它離開固定相，減小保留值，此即解締過程，顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。一般說來，固定相上的烷基配合基或被分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強，分配比k也越大，保留值越大。不難理解，在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。5離子色譜法、反相離子對色譜法與離子抑制色譜法的原理及應用范圍有何區(qū)別？離子色譜法(Ion Chromatography) ：用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。離子色譜法是

6、溶液中陰離子分析的最佳方法，也可用于陽離子分析。反相離子對色譜法(IPC或PIC) ：反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離。適用于較強的有機酸、堿。反相離子抑制色譜：在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達到改善分離的目的。適用于極弱酸堿物質(zhì)（pH=37弱酸；pH=78弱堿；兩性化合物）6親和色譜的分離機制是什么？有何特點？傳統(tǒng)的觀念認為親和色譜是基于配基-配體親和反應的原理，利用色譜的差速遷移理論，實現(xiàn)對目標分子的分離，僅僅是一種組分分離的選擇性過濾法。然而，這一理論是建立在配基-

7、配體親和作用是均相反應和宏觀平衡態(tài)熱力學的基礎上的。但是，實際上目標分子在兩相間分配系數(shù)過大，且在固定相上的吸附等溫線多不呈線性。所以，關于生物大分子在親和色譜中的保留機制及色譜過程數(shù)學模型的研究一直是一個相對薄弱的環(huán)節(jié)，有待進一步的完善.親和色譜具有較高的專屬性，經(jīng)其分離，純化，濃集后的生物樣品具有較高的純度，大大降低了后續(xù)測定(如HPLC)時的背景噪音，進而使得后續(xù)測定具有極高的靈敏度。7速率理論方程式在HPLC中與在GC中有何異同？如何指導HPLC實驗條件的選擇？解:液相色譜中引起色譜峰擴展的主要因素為渦流擴散、流動的流動相傳質(zhì)、滯留的流動相傳質(zhì)以及柱外效應。在氣相色譜中徑向擴散往往比較

8、顯著，而液相色譜中徑向擴散的影響較弱，往往可以忽略。另外，在液相色譜中還存在比較顯著的滯留流動相傳質(zhì)及柱外效應。在高效液相色譜中，對液液分配色譜，Van Deemter方程的完整表達形式為由此，HPLC的實驗條件應該是：小粒度、均勻的球形化學鍵合相；低粘度流動相，流速不宜過快；柱溫適當。8試討論影響HPLC分離度的各種因素，如何提高分離度？(1) 色譜填充性能液相色譜柱分離性能的優(yōu)劣，是由固定相粒度、柱長、由柱內(nèi)徑和填充狀況決定的柱壓降這三個參數(shù)度決定的。這三個參數(shù)度也決定了樣品組分的保留時間，保留時間不僅與色譜過程的熱力學因素k有關，還直接與決定柱效與分離度的柱性能參數(shù)及流動相的黏度有關，這

9、些參數(shù)都是影響色譜分離過程動力學的重要因素。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般都是購買商品柱，很少自行制備。(2) 流動相及流動相的極性液相色譜中，改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接因素。液相色譜不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。因此大多是恒溫分析。流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要，流動相可顯著改變組分分離狀況。(3) 流速流速大于0.5 cm/s時， Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。 9試討論反相HPLC的分離條件的選擇。反相HPLC法是以表面非極性載體為固定相，以比固

10、定相極性強的溶劑為流動相的種液相色譜分離模式。反相HPLC色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增。溶質(zhì)保留值與固定相表面積成正比，當其他條件相同時，溶質(zhì)在低表面積色譜柱上的保留值短。樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調(diào)整，溶劑強度取決于有機溶劑的性質(zhì)和其在流動相中的濃度。10在正、反相HPLC中流動相的強度是否相同？在正相色譜中，由于固定相是極性的，所以溶劑極性越強，洗脫能力也越強，即極性強的溶劑是強溶劑。在反相色譜中，由于固定相是非極性的，所以溶劑的強度隨溶劑的極性降低而增加，即極性弱的溶劑是強溶劑。11什么叫

11、梯度洗脫？它與GC的程序升溫有何異同？在一個分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相的組成或濃度配比，稱為梯度洗提。是改進液相色譜分離的重要手段。梯度洗提與氣相色譜中的程序升溫類似，但是前者連續(xù)改變的是流動相的極性、pH或離子強度，而后者改變的溫度。程序升溫也是改進氣相色譜分離的重要手段。12蒸發(fā)光散射檢測器的原理及特點是什么？蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporative Light-scattering Detector）是通用型檢測器，可以檢測沒有紫外吸收的有機物質(zhì)，如人參皂苷、黃芪甲苷等。一、ELSD原理 恒定流速的色譜儀（高效液相、逆流色譜、高效毛細管電泳等）洗脫液進入檢測器后，首先被高壓氣流

12、霧化，霧化形成的小液滴進入蒸發(fā)室(漂移管，drift tube)，流動相及低沸點的組分被蒸發(fā)，剩下高沸點組分的小液滴進入散射池，光束穿過散射池時被散射，散射光被光電管接收形成電信號，電信號通過放大電路、模數(shù)轉換電路、計算機成為色譜工作站的數(shù)字信號色譜圖。 二、特點 1洗脫液需要霧化，所以霧化氣流的純度和壓力會影響檢測器的信噪比。 2流動相要蒸發(fā)掉，所以不能使用不易揮發(fā)的物質(zhì)來調(diào)節(jié)流動相的pH值。可以通過蒸發(fā)溫度的調(diào)節(jié)來使比被測物質(zhì)沸點低的組分蒸發(fā)。在不使被測物質(zhì)蒸發(fā)的前提下，溫度越高，流動相蒸發(fā)越完全，色譜圖基線越好、信噪比越高。如果被測物質(zhì)沸點接近或低于流動相的蒸發(fā)溫度，則無法檢測；不過，1

13、00%的水做流動相，蒸發(fā)室溫度也才設為150攝氏度，沸點比水低的有機物質(zhì)完全可以用氣相色譜儀進行分離檢測了。由于流動相和溶劑蒸發(fā)了，使用ELSD檢測器收集的色譜圖一般沒有溶劑峰；而且梯度洗脫沒有折光視差效應，一般不會出現(xiàn)基線漂移。 3.檢測光散射變化，所有進入到散射池的物質(zhì)都可被檢測，而且響應值只與物質(zhì)的量有關。 4.濃度跟峰面積不成線性，分別取自然對數(shù)后成線性。13常用的HPLC定量分析方法是什么？哪些方法需要用校正因子校正峰面積？哪些方法可以不用校正因子？常用的HPLC定量分析方法有：外標法：外標工作曲線法、外標一點法、外標二點法等內(nèi)標法：內(nèi)標工作曲線法、內(nèi)標一點法、內(nèi)標二點法、內(nèi)標對比法

14、等使用內(nèi)標和外標標準曲線法時，可以不必測定校正因子，其它方法須要用校正因子校正峰面積14指出苯、萘、蒽在反相色譜中的洗脫順序并說明原因。三者極性順序從大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色譜中的洗脫順序為苯、萘、蒽，苯最先出峰。15宜用何種HPLC方法分離下列物質(zhì)？（1）乙醇和丁醇；（2）Ba2+和Sr2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）高摩爾質(zhì)量的葡糖苷。（1）正相鍵合相色譜法 （2）離子交換色譜法（3）離子對色譜法（4）空間排阻色譜法16欲測定二甲苯的混合試樣中對-二甲苯的含量。稱取該試樣110.0mg，加入對-二甲苯的對照品30.0 mg，用反相色譜法測定。加入對照品前后的色譜峰面積(mm2)值

15、為，對-二甲苯： 40.0，104.2；間-二甲苯：141.8，156.2。試計算對-二甲苯的百分含量。（20.0%）17計算例2中炔雌醇的校正因子及含量。 （3.02, 0.0369mg/片）18測定黃芩顆粒中的黃芩素的含量，實驗方法同例1。測得對照品溶液（5.98 g/ml）和供試品溶液的峰面積分別為：706436和458932，求黃芩顆粒中黃芩素的含量。 （1.55%）19測定生物堿試樣中黃連堿和小檗堿的含量，稱取內(nèi)標物、黃連堿和小檗堿對照品各0.2000g配成混合溶液。測得峰面積分別為3.60, 3.43和4.04cm2。稱取0.2400g內(nèi)標物和試樣0.8560g同法配制成溶液后，在相同色譜條件下測得峰面積為4.16, 3.71和4.54cm2。計算試樣中黃連堿和小檗堿的含量。（黃連堿26.2%，小檗堿27.3%）