高效液相色譜法習(xí)題答案[沐風(fēng)教育]

1、第二十章 高效液相色譜法思考題和習(xí)題1 簡(jiǎn)述高效液相色譜法和氣相色譜法的主要異同點(diǎn)。相同點(diǎn)：均為高效、高速、高選擇性的色譜方法，兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè) 不同點(diǎn)： 分析對(duì)象及范圍流動(dòng)相的選擇操作條件GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，占有機(jī)物的20%流動(dòng)相為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用小加溫常壓操作HPLC溶解后能制成溶液的樣品，高沸點(diǎn)、高分子量、難氣化、離子型的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，占有機(jī)物的80%流動(dòng)相為液體或各種液體的混合。它除了起運(yùn)載作用外，還可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離。室溫、高壓下進(jìn)行2何謂化學(xué)鍵合相？常用的化學(xué)鍵合相有哪幾種類(lèi)型？分別用于哪些液相色

2、譜法中？采用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液鍵合在載體表面上，所形成的填料稱(chēng)為化學(xué)鍵合相。優(yōu)點(diǎn)是使用過(guò)程不流失，化學(xué)性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，適于作梯度淋洗。目前常用的Si-O-Si-C型鍵合相，按極性分為非極性，中等極性與極性三類(lèi)。非極性鍵合相：常見(jiàn)如ODS鍵合相，既有分配又有吸附作用，用途非常廣泛，用于分析非極性或弱極性化合物；中等圾性鍵合相：常見(jiàn)的有醚基鍵合相，這種鍵合相可作正相或反相色譜的固定相，視流動(dòng)相的極性而定：極性鍵合相：常用氨基、氰基鍵合相，用作正相色譜的固定相，氨基鍵合相還是分離糖類(lèi)最常用的固定相。3什么叫正相色譜？什么叫反相色譜？各適用于分離哪些化合物？正相色譜法：流動(dòng)相極性小于固定相極

3、性的色譜法。用于分離溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)，用于含有不同官能團(tuán)物質(zhì)的分離。反相色譜法：流動(dòng)相極性大于固定相極性的色譜法。用于分離非極性至中等極性的分子型化合物。4簡(jiǎn)述反相鍵合相色譜法的分離機(jī)制。典型的反相鍵合色譜法是用非極性固定相和極性流動(dòng)相組成的色譜體系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）鍵合相；流動(dòng)相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色譜系統(tǒng)，用弱極性或中等極性的鍵合相和極性大于固定相的流動(dòng)相組成。 反相鍵合相表面具有非極性烷基官能團(tuán)，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，視覆蓋率而定。對(duì)于反相色譜的分離機(jī)制目前，保留機(jī)制還沒(méi)有一致的看法，大致有兩

4、種觀點(diǎn)，一種認(rèn)為屬于分配色譜，另一種認(rèn)為屬于吸附色譜。分配色譜的作用機(jī)制是假設(shè)混合溶劑（水十有機(jī)溶劑）中極性弱的有機(jī)溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動(dòng)相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進(jìn)行分配。吸附色譜的作用機(jī)制可用疏溶劑理論來(lái)解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的分子毛，這種分子毛有強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用水與有機(jī)溶劑所組成的極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離有機(jī)化合物時(shí)，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑作用，將會(huì)從水中被擠出來(lái)，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用，其結(jié)果使組分分子在固定相得到保留。另一方面，被分離物的極性部分

5、受到極性流動(dòng)相的作用，使它離開(kāi)固定相，減小保留值，此即解締過(guò)程，顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。一般說(shuō)來(lái)，固定相上的烷基配合基或被分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動(dòng)相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強(qiáng)，分配比k也越大，保留值越大。不難理解，在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。5離子色譜法、反相離子對(duì)色譜法與離子抑制色譜法的原理及應(yīng)用范圍有何區(qū)別？離子色譜法(Ion Chromatography) ：用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。離子色譜法是

6、溶液中陰離子分析的最佳方法，也可用于陽(yáng)離子分析。反相離子對(duì)色譜法(IPC或PIC) ：反相色譜中，在極性流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使被測(cè)組分與其中的反離子形成中性離子對(duì)，增加k和tR，以改善分離。適用于較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿。反相離子抑制色譜：在反相色譜中，通過(guò)加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達(dá)到改善分離的目的。適用于極弱酸堿物質(zhì)（pH=37弱酸；pH=78弱堿；兩性化合物）6親和色譜的分離機(jī)制是什么？有何特點(diǎn)？傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為親和色譜是基于配基-配體親和反應(yīng)的原理，利用色譜的差速遷移理論，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的分離，僅僅是一種組分分離的選擇性過(guò)濾法。然而，這一理論是建立在配基-

7、配體親和作用是均相反應(yīng)和宏觀平衡態(tài)熱力學(xué)的基礎(chǔ)上的。但是，實(shí)際上目標(biāo)分子在兩相間分配系數(shù)過(guò)大，且在固定相上的吸附等溫線多不呈線性。所以，關(guān)于生物大分子在親和色譜中的保留機(jī)制及色譜過(guò)程數(shù)學(xué)模型的研究一直是一個(gè)相對(duì)薄弱的環(huán)節(jié)，有待進(jìn)一步的完善.親和色譜具有較高的專(zhuān)屬性，經(jīng)其分離，純化，濃集后的生物樣品具有較高的純度，大大降低了后續(xù)測(cè)定(如HPLC)時(shí)的背景噪音，進(jìn)而使得后續(xù)測(cè)定具有極高的靈敏度。7速率理論方程式在HPLC中與在GC中有何異同？如何指導(dǎo)HPLC實(shí)驗(yàn)條件的選擇？解:液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素為渦流擴(kuò)散、流動(dòng)的流動(dòng)相傳質(zhì)、滯留的流動(dòng)相傳質(zhì)以及柱外效應(yīng)。在氣相色譜中徑向擴(kuò)散往往比較

8、顯著，而液相色譜中徑向擴(kuò)散的影響較弱，往往可以忽略。另外，在液相色譜中還存在比較顯著的滯留流動(dòng)相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)。在高效液相色譜中，對(duì)液液分配色譜，Van Deemter方程的完整表達(dá)形式為由此，HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是：小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相；低粘度流動(dòng)相，流速不宜過(guò)快；柱溫適當(dāng)。8試討論影響HPLC分離度的各種因素，如何提高分離度？(1) 色譜填充性能液相色譜柱分離性能的優(yōu)劣，是由固定相粒度、柱長(zhǎng)、由柱內(nèi)徑和填充狀況決定的柱壓降這三個(gè)參數(shù)度決定的。這三個(gè)參數(shù)度也決定了樣品組分的保留時(shí)間，保留時(shí)間不僅與色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素k有關(guān)，還直接與決定柱效與分離度的柱性能參數(shù)及流動(dòng)相的黏度有關(guān)，這

9、些參數(shù)都是影響色譜分離過(guò)程動(dòng)力學(xué)的重要因素。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般都是購(gòu)買(mǎi)商品柱，很少自行制備。(2) 流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性液相色譜中，改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接因素。液相色譜不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。因此大多是恒溫分析。流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要，流動(dòng)相可顯著改變組分分離狀況。(3) 流速流速大于0.5 cm/s時(shí)， Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。 9試討論反相HPLC的分離條件的選擇。反相HPLC法是以表面非極性載體為固定相，以比固

10、定相極性強(qiáng)的溶劑為流動(dòng)相的種液相色譜分離模式。反相HPLC色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類(lèi)和濃度決定，保留值通常隨鏈長(zhǎng)增長(zhǎng)或鍵合相的疏水性增強(qiáng)而增。溶質(zhì)保留值與固定相表面積成正比，當(dāng)其他條件相同時(shí)，溶質(zhì)在低表面積色譜柱上的保留值短。樣品的保留值也可以通過(guò)改變流動(dòng)相組成或溶劑強(qiáng)度來(lái)調(diào)整，溶劑強(qiáng)度取決于有機(jī)溶劑的性質(zhì)和其在流動(dòng)相中的濃度。10在正、反相HPLC中流動(dòng)相的強(qiáng)度是否相同？在正相色譜中，由于固定相是極性的，所以溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即極性強(qiáng)的溶劑是強(qiáng)溶劑。在反相色譜中，由于固定相是非極性的，所以溶劑的強(qiáng)度隨溶劑的極性降低而增加，即極性弱的溶劑是強(qiáng)溶劑。11什么叫

11、梯度洗脫？它與GC的程序升溫有何異同？在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的組成或濃度配比，稱(chēng)為梯度洗提。是改進(jìn)液相色譜分離的重要手段。梯度洗提與氣相色譜中的程序升溫類(lèi)似，但是前者連續(xù)改變的是流動(dòng)相的極性、pH或離子強(qiáng)度，而后者改變的溫度。程序升溫也是改進(jìn)氣相色譜分離的重要手段。12蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的原理及特點(diǎn)是什么？蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative Light-scattering Detector）是通用型檢測(cè)器，可以檢測(cè)沒(méi)有紫外吸收的有機(jī)物質(zhì)，如人參皂苷、黃芪甲苷等。一、ELSD原理 恒定流速的色譜儀（高效液相、逆流色譜、高效毛細(xì)管電泳等）洗脫液進(jìn)入檢測(cè)器后，首先被高壓氣流

12、霧化，霧化形成的小液滴進(jìn)入蒸發(fā)室(漂移管，drift tube)，流動(dòng)相及低沸點(diǎn)的組分被蒸發(fā)，剩下高沸點(diǎn)組分的小液滴進(jìn)入散射池，光束穿過(guò)散射池時(shí)被散射，散射光被光電管接收形成電信號(hào)，電信號(hào)通過(guò)放大電路、模數(shù)轉(zhuǎn)換電路、計(jì)算機(jī)成為色譜工作站的數(shù)字信號(hào)色譜圖。 二、特點(diǎn) 1洗脫液需要霧化，所以霧化氣流的純度和壓力會(huì)影響檢測(cè)器的信噪比。 2流動(dòng)相要蒸發(fā)掉，所以不能使用不易揮發(fā)的物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值?？梢酝ㄟ^(guò)蒸發(fā)溫度的調(diào)節(jié)來(lái)使比被測(cè)物質(zhì)沸點(diǎn)低的組分蒸發(fā)。在不使被測(cè)物質(zhì)蒸發(fā)的前提下，溫度越高，流動(dòng)相蒸發(fā)越完全，色譜圖基線越好、信噪比越高。如果被測(cè)物質(zhì)沸點(diǎn)接近或低于流動(dòng)相的蒸發(fā)溫度，則無(wú)法檢測(cè)；不過(guò)，1

13、00%的水做流動(dòng)相，蒸發(fā)室溫度也才設(shè)為150攝氏度，沸點(diǎn)比水低的有機(jī)物質(zhì)完全可以用氣相色譜儀進(jìn)行分離檢測(cè)了。由于流動(dòng)相和溶劑蒸發(fā)了，使用ELSD檢測(cè)器收集的色譜圖一般沒(méi)有溶劑峰；而且梯度洗脫沒(méi)有折光視差效應(yīng)，一般不會(huì)出現(xiàn)基線漂移。 3.檢測(cè)光散射變化，所有進(jìn)入到散射池的物質(zhì)都可被檢測(cè)，而且響應(yīng)值只與物質(zhì)的量有關(guān)。 4.濃度跟峰面積不成線性，分別取自然對(duì)數(shù)后成線性。13常用的HPLC定量分析方法是什么？哪些方法需要用校正因子校正峰面積？哪些方法可以不用校正因子？常用的HPLC定量分析方法有：外標(biāo)法：外標(biāo)工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法、外標(biāo)二點(diǎn)法等內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)對(duì)比法

14、等使用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法時(shí)，可以不必測(cè)定校正因子，其它方法須要用校正因子校正峰面積14指出苯、萘、蒽在反相色譜中的洗脫順序并說(shuō)明原因。三者極性順序從大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色譜中的洗脫順序?yàn)楸健⑤?、蒽，苯最先出峰?5宜用何種HPLC方法分離下列物質(zhì)？（1）乙醇和丁醇；（2）Ba2+和Sr2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）高摩爾質(zhì)量的葡糖苷。（1）正相鍵合相色譜法 （2）離子交換色譜法（3）離子對(duì)色譜法（4）空間排阻色譜法16欲測(cè)定二甲苯的混合試樣中對(duì)-二甲苯的含量。稱(chēng)取該試樣110.0mg，加入對(duì)-二甲苯的對(duì)照品30.0 mg，用反相色譜法測(cè)定。加入對(duì)照品前后的色譜峰面積(mm2)值

15、為，對(duì)-二甲苯： 40.0，104.2；間-二甲苯：141.8，156.2。試計(jì)算對(duì)-二甲苯的百分含量。（20.0%）17計(jì)算例2中炔雌醇的校正因子及含量。 （3.02, 0.0369mg/片）18測(cè)定黃芩顆粒中的黃芩素的含量，實(shí)驗(yàn)方法同例1。測(cè)得對(duì)照品溶液（5.98 g/ml）和供試品溶液的峰面積分別為：706436和458932，求黃芩顆粒中黃芩素的含量。 （1.55%）19測(cè)定生物堿試樣中黃連堿和小檗堿的含量，稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)物、黃連堿和小檗堿對(duì)照品各0.2000g配成混合溶液。測(cè)得峰面積分別為3.60, 3.43和4.04cm2。稱(chēng)取0.2400g內(nèi)標(biāo)物和試樣0.8560g同法配制成溶液后，在相同色譜條件下測(cè)得峰面積為4.16, 3.71和4.54cm2。計(jì)算試樣中黃連堿和小檗堿的含量。（黃連堿26.2%，小檗堿27.3%）