生物選修三基因工程課件34張

1、一,基因工程定義,即,基因拼接技術(shù)或,DNA,重組技術(shù),通俗的,說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來(lái),加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里,定向,地改造生,物的,遺傳性狀,原,理,操作水平,意,義,基因重組,DNA,分子水平,1,定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人,類所需要的品種,目的性強(qiáng),2,克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙,基因工程,工,具,限制酶，運(yùn)載體，連接酶,基因的剪刀限制性核酸內(nèi)切酶,2,功能特點(diǎn),3,結(jié)果,能識(shí)別,一種特定的核苷酸序列,并在特定的位點(diǎn)將,DNA,分子切斷,產(chǎn)生,粘性末端或平末端,1,來(lái)源,主要,來(lái)源于,細(xì)菌,等原核生物,酵母菌,中也有,切割的本質(zhì),在特定

2、位點(diǎn)水解,磷酸二酯鍵,思考題,要想獲得目的基因，其必須含有幾個(gè)相應(yīng)限,制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)？可產(chǎn)生幾個(gè)粘性末端,目的基因左右,各一個(gè),識(shí)別位點(diǎn)，產(chǎn)生,4,個(gè)粘性末端,目的基因,基因的針線DNA連接酶,連接酶的作用是：將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接,起來(lái),連接磷酸二酯鍵,，使之成為一個(gè)完整的,DNA,分子,種類及作用,E.coliDNA,連接酶：連接粘性末端,T,4,DNA,連接酶：連接粘性末端和平末端（低效,基因的運(yùn)輸工具運(yùn)載體,常用的運(yùn)載體,質(zhì),粒,噬菌體的衍生物,和,動(dòng)植物病毒,標(biāo)記基因，便于對(duì),重組,DNA,進(jìn)行檢測(cè),和篩選,質(zhì)粒應(yīng)具備以下幾個(gè)條件,有,多個(gè),限制酶切割位點(diǎn)，供外源,D

3、NA,插入,在,受體細(xì)胞,內(nèi)能,自主復(fù)制,和,穩(wěn)定的保存,具備,特殊的,標(biāo)記基因,供重組,DNA,的鑒定和選擇,對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害,但,天然質(zhì)粒,往往不能滿足上述要求，因此需要根據(jù)不同目,的和需要，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行人工改造,現(xiàn)在所使用的質(zhì)粒幾乎都是,經(jīng)過(guò)改造的,DNA,分子相關(guān)的酶的比較,種類,項(xiàng)目,限制酶,DNA,連,接酶,DNA,聚合,酶,解旋酶,作用底,物,DNA,分,子,DNA,分,子,片段,脫氧核,苷酸,DNA,分子,作用部,位,磷酸二,酯鍵,磷酸二,酯鍵,磷酸二,酯鍵,堿基對(duì)間的,氫鍵,作用結(jié),果,形成黏,性末端,或平末,端,形成重,組,DNA,分子,形成新,的,DNA,分子,形成單鏈,DN

4、A,分子,第一步,獲取目的基因,第二步,目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（構(gòu)建表達(dá)載體,第三步,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,第四步,目的基因的表達(dá)和檢測(cè),二,基因工程基本步驟,獲得目的基因的方法,從基因文庫(kù)中獲取目的基因（目的基因序列位置,利用,PCR,技術(shù)擴(kuò)增目的基因（目的基因序列已知,人工合成法,_,和,_,反轉(zhuǎn)錄法,DNA,合成儀合成,基因組文庫(kù),cDNA,文庫(kù),利用,PCR,技術(shù)擴(kuò)增目的基因,目的基因序列已知,PCR,是一項(xiàng)在生物體外,復(fù)制,特定,DNA,片段的核酸合成技術(shù),條件,模板，原料，引物,Taq,酶,原理,DNA,復(fù)制,過(guò)程,第一步：加熱至,90,95,DNA,解鏈,變性,第二步：冷卻到,5

5、5,60,引物結(jié)合到互補(bǔ),DNA,鏈,退火,第三步：加熱至,70,75,DNA,聚合酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈,的合成,延伸,方式：指數(shù)擴(kuò)增,2,n,n,為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù),注意：第三個(gè)循環(huán)才能得到真正的目的基因,PCR,技術(shù)擴(kuò)增與,DNA,復(fù)制的比較,PCR,技術(shù),DNA,復(fù)制,相,同,點(diǎn),原理,原料,條件,不,同,點(diǎn),解旋,方式,場(chǎng)所,酶,結(jié)果,DNA,復(fù)制,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在高溫下,變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的,DNA,聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整個(gè),DNA,分子,RNA,指導(dǎo)的,DNA,聚合酶活性,RNase H

6、,活性,DNA,指導(dǎo)的,DNA,聚合酶活性,反轉(zhuǎn)錄法,逆轉(zhuǎn)錄酶,具有多種酶活性,構(gòu)建表達(dá)載體,基因工程核心步驟,1,構(gòu)建表達(dá)載體的目的,2,表達(dá)載體的組成及作用,目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以,遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用,基,因,表,達(dá),載,體,的,組,成,目的基因,啟動(dòng)子,一段有特,殊結(jié)構(gòu)的,DNA,短片段,位置：位于目的基因首端,功能,RNA,聚合酶,識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn),驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出,mRNA,終止子,一段有特,殊結(jié)構(gòu)的,DNA,短片段,位置：位于目的基因尾端,功能：終止轉(zhuǎn)錄,標(biāo)記基因,鑒別受體細(xì)胞中是否含有,目的基因,從而篩選,1,用一定的,_,切割,

7、質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切,口，露出,_,2,用,_,切斷目,的基因，使其產(chǎn)生,_,_,3,將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的,_,處，再加入適量,_,形成了一個(gè)重組,DNA,分子,基因表達(dá)載體,重組質(zhì)粒,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA,連接酶,相同,基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法,用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使之露出相同的粘性末端,再加入,DNA,連接酶,3,過(guò)程,思考,若用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒,如果,兩兩結(jié)合,可以形成幾種不同的重組,DNA,如何解決以上存在的問(wèn)題呢,目的基因,目的基因連接物、目的基因,載體連接物,載體,載體的連接物,如果不考慮兩兩結(jié)合，

8、還可能有,目的基因,載體的自身連接（自身環(huán)化,防止質(zhì)粒和含有目的基因的外源,DNA,片段自身環(huán)化,雙酶切,常用的受體細(xì)胞,大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等,為什么受體細(xì)胞通常用微生物細(xì)胞,繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)人受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持,穩(wěn)定,和,表達(dá),的過(guò)程,選修,3 P12,目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,受體細(xì)胞可以是,體細(xì)胞或受精卵,細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物中常用的方法,花粉管通道法：我國(guó)獨(dú)創(chuàng)的一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的方法,基因槍法：?jiǎn)巫尤~植物中常用的方法，成本較高,方法,農(nóng)桿菌,轉(zhuǎn)化,法,過(guò)程,目的基因插人農(nóng)桿菌質(zhì)粒的,T-DN

9、A,中，形成重組,Ti,質(zhì)粒,農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因整合到植物細(xì)胞染色體上,目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá),目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,受體細(xì)胞是：受精卵,方法,顯微注射技術(shù),操作程序：含有目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵,顯微注,射注射了目的基因的受精卵移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi),發(fā)育新性狀動(dòng)物,目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,受體細(xì)胞一般是：原核生物細(xì)胞,原核生物特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等,方法：制備感受態(tài)法,過(guò)程,處理細(xì)胞,細(xì)胞表達(dá)載體與感,受態(tài)細(xì)胞混合,_,細(xì)胞吸收,DNA,分子,1,圖中質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素兩個(gè)標(biāo)記基因,經(jīng)過(guò)和步驟后，有些質(zhì)粒上的,_,基因

10、內(nèi)插入了外源目的基因，形,成重組質(zhì)粒，由于目的基因的分隔使得該抗性基因失活,2,步驟,_,的過(guò)程，為了促進(jìn)該過(guò)程，應(yīng)該用,_,處理,大腸桿菌,氨芐青霉素抗性,將重組質(zhì)粒（目的基因）導(dǎo)入大腸桿菌（受體細(xì)胞,CaCl2,溶液,篩選,含有目的基因的,受體細(xì)胞,4,步驟：將三角瓶?jī)?nèi)的大腸桿菌接種到含四環(huán)素的,培養(yǎng)基,C,上培養(yǎng)，目的是篩選,_,能在,C,中,生長(zhǎng)的腸桿菌有,_,種,5,步驟：用無(wú)菌牙簽桃取,C,上的單個(gè)菌落，分別接,種到,D,含氨芐青霉素和四環(huán)素）和,E,含四環(huán)素）兩個(gè),培養(yǎng)基的相同位置上，一段時(shí)間后，菌落的生長(zhǎng)狀況如圖,所示。含目的基因的菌落位于,_,D,E,上,請(qǐng)?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上

11、圈出來(lái),含四環(huán)素抗性基因的,大腸桿菌,2,E,4,目的基因的檢測(cè)與鑒定,1,首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體,DNA,上是否插入了目,的基因，方法是采用,_,2,其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了,mRNA,方法是,采用,_,3,最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基,因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行,_,4,有時(shí)還需進(jìn)行,_,的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng),植物是否出現(xiàn)抗蟲(chóng)性狀,個(gè)體生物學(xué)水平,DNA,分子雜交技術(shù),用標(biāo)記的目的基因作探針與,mRNA,雜交,抗原抗體雜交,如用棉花葉喂蟲(chóng)，看害蟲(chóng)食用后是否死亡來(lái)判斷毒蛋白,基因在棉花植株上的表達(dá),基因工程的應(yīng)用,一、基因工程取得的成果,1,植物基因

12、工程：抗蟲(chóng)、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用,轉(zhuǎn)基因改良植物的,_,2,動(dòng)物基因工程：提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì),用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn),_,用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體,3,基因治療,_,導(dǎo)入病人體內(nèi)，使該基,因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮作用,把正常的外源基因,品質(zhì),藥物,1,基因診斷,1,原理,DNA,分子雜交,2,過(guò)程：制備用放射性同位素、熒光分子等標(biāo)記的,DNA,患者,DNA,分子作探針；將待測(cè),DNA,制成單鏈；讓兩者進(jìn)行雜交,若兩者能進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，則說(shuō)明患有此病，否則不患此病,2,基因治療,1,原理：把正常的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，達(dá)到治,療疾病的目的。病人細(xì)胞中既有缺陷基因，也有正?；?蛋白質(zhì)工程,蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能,的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò),_,或,_,對(duì)現(xiàn),有蛋白質(zhì)進(jìn)行,_,或制造一種,_,以,滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。（基因工程在原則上只,能生產(chǎn),_,的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)工程的崛起,自然界已存在,基因修