犬β干擾素的表達及其抗細小病毒復制的研究

1、犬干擾素的表達及其抗細小病毒復制的研究犬細小病毒（ Canine Parvovirus,CPV）病作為危害犬類健康最嚴重的傳染病之一 , 對犬類的健康和生存有著巨大的威脅。隨著時間的變化CPV也在不斷地發(fā)生變異 , 給此病的預防與治療帶來巨大挑戰(zhàn)。干擾素（interferon,IFN）是一種廣泛表達于脊椎動物體內的多功能細胞因子 , 并且具有一系列的生物活性如抗病毒、抗增殖、抗腫瘤及免疫調節(jié)作用。其中 IFN- 是天然免疫和適應性免疫中的一個重要的中間誘導分子和效應分子,它對抗病毒機制的獨特作用是IFN- 及其亞型無法代替和彌補。現(xiàn)有的動物干擾素主要采用原核表達的方法來制備, 需要經過變性和復

2、性的過程來獲得具有活性的蛋白質, 生產工藝復雜 , 大大限制了干擾素在獸醫(yī)臨床上的應用 , 而利用真核細胞表達的干擾素更接近天然干擾素的結構。相比大腸桿菌表達的犬 IFN- ,CHO表達的干擾素具有良好的抗病毒活性和免疫原性, 并且副作用更小。本研究從貴州大學動物醫(yī)院采集犬血液, 利用分離的外周血淋巴細胞中來提取總 DNA,PCR擴增犬 IFN- 基因 , 克隆并進行序列分析 ; 構建犬 IFN- 真核表達質粒 , 將其在 CHO-K1細胞中表達 , 并研究其對 CPV的抗病毒活性。本論文主要研究內容包括 :1. 犬 IFN- 基因的擴增、克隆及序列分析根據(jù)GenBank登錄的犬IFN- 基因

3、序列（ FJ194477）設計合成特異性引物 , 通過 PCR從犬外周血淋巴細胞總 DNA中擴增 IFN- 基因 CDS區(qū)并進行克隆測序。運用生物信息學方法對犬IFN- 基因進行序列分析 , 并對其理化性質以及編碼蛋白質的二級結構、三級結構進行預測, 構建分子系統(tǒng)進化樹。結果顯示:犬 IFN- 基因編碼區(qū)全長561 bp, 共編碼 186 個氨基酸 , 其分子式可表示為C1014H1593N263O290S9, 分子質量為 22.40 ku; 屬于親水性蛋白 , 理論等電點為 5.98; 犬 IFN- 含有豐富的二級結構 , 以螺旋（ 76.88%）和無規(guī)卷曲（ 19.35%）為主, 蛋白質三

4、級結構呈彎曲螺旋結構 ; 與貉、威德爾海豹、金錢豹、家貓、寬吻海豚、人、雞和綠頭鴨相對應序列核苷酸序列同源性分別為98.4%、87.2%、85.2%、84.7%、79%、74.9%、43.9%和 43.3%。同源性及系統(tǒng)進化樹分析結果表明犬與貉IFN- 核苷酸同源性最高（為98.4%）, 親緣關系最近。 2. 犬 IFN- 基因重組真核表達載體的構建及其表達鑒定本研究主要構建犬IFN- 基因重組真核表達載體, 對犬 IFN- 在 CHO-K1細胞中的表達進行鑒定。將上一步擴增得到的目的基因亞克隆至pEGPF-C1載體上 , 構建得到重組真核表達質粒 pEGPF-C1-IFN-, 并通過 PCR

5、、酶切以及測序確認。 利用脂質體將重組質粒轉染 CHO-K1細胞 , 轉染后 48 h 收集細胞并提取總蛋白。Western-blotting結果顯示 , 表達產物能與抗 GFP標簽鼠單克隆抗體特異性結合 , 在 55ku 處出現(xiàn)目的蛋白表達產物。本實驗成功構建出犬IFN- 基因重組真核表達載體 pEGPF-C1-IFN-, 并在 CHO-K1細胞中成功表達。3. 犬重組 IFN- 對 CPV復制的影響將 F81 細胞進行傳代 , 設立四組實驗組分別為陽性組、陰性對照組、空白對照組和控制對照組。陽性組加入1 mLCaIFN-真核表達產物 , 預處理 F81 細胞 5h, 然后接種 CPV。陰性對照組 , 加入空載體 pEGFP-C1真核表達產物 1 mL, 預處理 F81 細胞 5 h后接種 CPV?？瞻讓φ战M傳代5 h 后直接接種 CPV,控制對照組均不加。通過光學顯微鏡觀察細胞病變, 四組接種后分別于12 h 、24 h 以及 36 h 收集細胞懸液 , 反復凍融 3 次后收集病毒 , 并提取 DNA,進行 CPV-VP2基因