代謝調(diào)控-第一章-緒論P(yáng)PT課件

1、2021/3/2,代謝控制Regulation of Metabolism,主講教師：郭金玲,2021/3/2,第一章 緒論,2、代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)的必然性,1、發(fā)酵技術(shù)是工業(yè)生物技術(shù)的核心技術(shù),5、課程內(nèi)容和學(xué)習(xí)方法,3、代謝工程的基本思想,4、正向代謝工程面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢,2021/3/2,尋求化石資源的替代已經(jīng)成為社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重大戰(zhàn)略,社會經(jīng)濟(jì) 可持續(xù)發(fā)展,1、發(fā)酵技術(shù)是工業(yè)生物技術(shù)的核心技術(shù),2021/3/2,可持續(xù)發(fā)展的兩個方面： 以可再生生物資源取代化石資源，以可再生生物能源取代不可再生化石能源; 以清潔高效的生物加工方式取代低效污染的傳統(tǒng)物質(zhì)加工方式，以精細(xì)產(chǎn)品取代大量

2、粗加工產(chǎn)品,背景,2021/3/2,Renewable raw materials,Biofuels Biomaterials Chemicals Foodstaffs etc,微生物細(xì)胞工廠,環(huán)境、資源、能源,2021/3/2,2001年大型跨國公司美國Cargill-Dow公司利用玉米為原料生產(chǎn)聚乳酸（14萬噸/年），是工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)興起的標(biāo)志,淀粉,糖化,乳酸,聚乳酸,發(fā)酵,生物材料,2021/3/2,以淀粉、再生纖維素等原料，實(shí)現(xiàn)聚酯、聚乳酸、聚氨基酸等生物可降解材料的低成本生產(chǎn)，逐步減少對化石資源的依賴與環(huán)境污染,2021/3/2,十一五”以來我國生物產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值以年均22.9%的速度

3、增長，2011年實(shí)現(xiàn)總產(chǎn)值約2萬億元。爭取到2020年，把生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展成為國民經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè),2021/3/2,問題,微生物既不會使代謝物大量積累而造成浪費(fèi)，也不會因代謝物的缺失而供不應(yīng)求。微生物會保持各種代謝物濃度的相對穩(wěn)定和動態(tài)平衡，適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化,如何使微生物過量積累某種代謝產(chǎn)物,2021/3/2,代謝控制發(fā)酵：利用遺傳學(xué)或其它生物化學(xué)的方法，人為地在脫氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，改變和控制微生物的代謝，使有用的代謝產(chǎn)物大量生成、積累的發(fā)酵技術(shù),2、代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)的必然性,2021/3/2,微生物代謝調(diào)控機(jī)制能否被解除是代謝控制發(fā)酵的關(guān)鍵所在,研究方法：先研究目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成

4、路徑、遺傳控制及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，然后定向選育大量積累目標(biāo)產(chǎn)物的微生物,2021/3/2,代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)和發(fā)展的現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ),生物化學(xué),酶的變構(gòu)動力學(xué),各種操縱子調(diào)控機(jī)制,誘變育種,原生質(zhì)體融合等,重組DNA技術(shù),發(fā)酵過程控制,合成途徑+調(diào)節(jié)機(jī)制,菌株改造技術(shù),菌株發(fā)酵環(huán)境,2021/3/2,正向(Constructive)代謝工程,1991年Bailey J E 在Science上正式提出，基本思想是： 根據(jù)已有的遺傳和生化知識，找出限速步驟，進(jìn)行遺傳操作,3、代謝工程基本思路,2021/3/2,代謝工程定義,采用重組DNA技術(shù)和高精度的分析生物學(xué)技術(shù)相關(guān)的遺傳學(xué)方法，進(jìn)行精確目標(biāo)的基因操作，改變

5、微生物原有調(diào)節(jié)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)提高目的代謝活性和目的代謝產(chǎn)物量,2021/3/2,代謝工程的具體思路,改變代謝流,擴(kuò)展或構(gòu)建新的代謝途徑,2021/3/2,碳水化合物原料,C3,酸P,酸P,實(shí)現(xiàn)代謝途徑重構(gòu),2021/3/2,NAD,NADH,Pyruvate,PDC,Acetaldehyde,Ethanol,ADH,Acetaldehyde,110,丙酮酸產(chǎn)率提高44,提高乙醇脫氫酶活性,加速速度限制反應(yīng),2021/3/2,改變分支代謝途徑的流向,Glucose,Pyruvate,Alanine,Acetaldehyde,Ethanol,Citrate,OAA,KG,AcCoA,Pyruvate,

6、OAA,B1： 硫胺素 NA： 煙酸 Bio：生物素 B6： 吡哆醛,光滑球擬酵母中丙酮酸代謝途徑,X,X,X,X,策略： 選育維生素缺陷型酵母,目標(biāo)：積累丙酮酸,2021/3/2,Nissen等在Azotobacter vinelandii 基因雙缺失型菌株中構(gòu)建了一個產(chǎn)生NAD+的新途徑，使甘油減少40,3-磷酸甘油醛脫氫酶 （ GDP1和GDP2基因,NAD,構(gòu)建代謝旁路,2021/3/2,改變能量代謝途徑,丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高42.9,發(fā)酵時間 縮短23,抑制氧化磷酸化途徑提高酵解速度,丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高42.9,發(fā)酵時間 縮短23,2021/3/2,Okumagai等從巴斯德畢赤氏酵母

7、中分離了一個不受乙醇阻遏的醇氧化酶基因(AOX1)啟動子表達(dá)淀粉酶基因使淀粉酶分泌量大大提高，這個工程菌可以由淀粉直接發(fā)酵乙醇，以3淀粉至少產(chǎn)生2乙醇,延伸代謝途徑,2021/3/2,P.stipitis中分離到木糖還原酶基因XYL1和木糖醇 脫氫酶XYL2基因,將其克隆進(jìn)S.cerevisiae,木糖還原酶,木糖醇脫氫酶,構(gòu) 建 新 的 生 物 合 成 途 徑,2021/3/2,正向代謝工程問題的提出,天然存在的各種基因或經(jīng)改造的各種新基因足于應(yīng)付代謝工程的需要，但要使代謝工程的目標(biāo)真正實(shí)現(xiàn)卻只有很少一部分基因有效，要找到這一小部分基因無益大海撈針。 對于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，傳統(tǒng)的代謝工程思路遇到了難

8、題,4、正向代謝工程面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展趨勢,2021/3/2,1996年Bailey J E首次提出“反向代謝工程”的概念,反向代謝工程的興起,2021/3/2,反向代謝工程的基本思想是： 對實(shí)驗(yàn)室菌株（或野生型）的突變、定向進(jìn)化和定向篩選，獲得預(yù)期的表型，并確定其基因型。 選擇工業(yè)菌株并對其相應(yīng)基因進(jìn)行遺傳操作，以期獲得同樣的表型,2021/3/2,目前為止，反向代謝工程在很多方面的應(yīng)用都獲得成功,逆代謝工程避免了對復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的充分認(rèn)識過程，解決了許多正向代謝工程思路解決不了的問題,2021/3/2,Khosla和Bailey：專性需氧透明顫菌在限氧條件下合成了大量的透明顫菌血紅蛋白VHb,

9、合成血紅蛋白可能是透明顫菌在氧限制條件下提高代謝和生長的一種“基因策略,表達(dá)VHb的大腸桿菌在限氧條件下可達(dá)到較高生 長密度,將該血紅蛋白的基因克隆到一系列需氧工業(yè)微生 物中,實(shí)例,2021/3/2,在人們并不知道VHb產(chǎn)生途徑及影響機(jī)制的前提下，上述方法成功解決了限氧的瓶頸。正是這些成功的實(shí)例推動了對VHb的重新認(rèn)識,2021/3/2,逆代謝工程的關(guān)鍵在于確定希望表型的遺傳基礎(chǔ)。 微生物和細(xì)胞培養(yǎng)積累的關(guān)于遺傳刺激表型反應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，以及標(biāo)準(zhǔn)微生物系統(tǒng)遺傳、生理和生物化學(xué)特性方面的研究成果，加上高度自動化的現(xiàn)代分析工具，將使基因和表型之間相關(guān)性分析變得越來越容易,代謝工程的前景,2021/3/

10、2,蛋白質(zhì)工程的興起，使代謝工程僅僅利用天然存在的基因克隆這一局限將被打破，從而解除原有細(xì)胞代謝的很多限制因素。 這種逆向思維已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了逆代謝工程創(chuàng)立之初的設(shè)想，并將成為代謝工程研究的主流方向,2021/3/2,5. 課程主要內(nèi)容,1、緒論 2、代謝控制發(fā)酵的基本思想 3、代謝控制發(fā)酵育種的基本技術(shù) 4、糖代謝與控制 5、脂類代謝與控制 6、氨基酸代謝與控制 7、核酸類物質(zhì)的代謝控制與發(fā)酵 8、抗生素發(fā)酵的代謝與控制,2021/3/2,1、抓住課程內(nèi)容的基本邏輯結(jié)構(gòu) 2、認(rèn)真理解和體會其中的原理和技術(shù) 3、結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步鞏固所學(xué)的理論 4、課后要及時復(fù)習(xí)和總結(jié)所學(xué)習(xí)的知識,學(xué)習(xí)方法,2021/3/2,參考書目,使用教材： 張克旭等編著代謝控制發(fā)酵 中國輕工業(yè)出版社，2004年 參考書目： 陶文沂編著工業(yè)微生物生理與遺傳育種學(xué) 中國輕工業(yè)出版社，1997年 王鏡巖等編著生物化學(xué)（第三版） 高等教育出版社，200