普洱茶色素提取、分級(jí)及生物活性研究

1、普洱茶色素提取、分級(jí)及生物活性研究普洱茶屬于后發(fā)酵茶 , 是中國(guó)特有的名優(yōu)黑茶之一, 具有多種特殊的保健功效 , 深受廣大消費(fèi)者歡迎。而普洱茶色素被認(rèn)為是其藥理作用的主要成分之一。目前 , 關(guān)于普洱茶色素的化學(xué)組成、性質(zhì)及藥理作用機(jī)理已成為普洱茶研究不可回避且十分重要的難題。本文著手研究普洱茶色素提取、分級(jí)及生物活性,以期對(duì)茶色素 , 尤其是對(duì)普洱茶色素依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后余下的水層 ( 水溶性色素 ) 的組成與性質(zhì)復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)能較前人更為深入, 并豐富茶葉科學(xué)的相關(guān)理論及合理闡明普洱茶色素藥理作用的部分機(jī)理。本研究的主要結(jié)果如下： 1. 普洱茶色素提取工藝條件的響應(yīng)面分析及

2、其抗氧化性活性研究首次將普洱茶色素溶液與蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)液的色差E 值作為色素提取的評(píng)價(jià)指標(biāo) , 可以簡(jiǎn)單、安全和快速評(píng)價(jià)普洱茶色素在不同浸提條件下的效果差異。通過(guò)二次回歸設(shè)計(jì)得到了普洱茶色素提取色差E 與料液比、 溫度、浸提時(shí)間的回歸模型 , 并研究了普洱茶色素對(duì)1,1- 二苯基 -2- 苦基肼自由基 (DPPH) 的清除作用。若僅從色素提取的色差E 大小考慮 , 利用響應(yīng)優(yōu)化器得到色素提取的優(yōu)化工藝參數(shù)為：液料比45： 1(mL/g) 、提取溫度 100、提取時(shí)間 150 min, 色素提取色差 E 為 52.97, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%, 與預(yù)測(cè)值相差 1.3%, 高出單因素試驗(yàn)和Box-

3、Behnken 組合中的最高色差E 4.73%。普洱茶色素對(duì)DPPH自由基具有良好的清除能力 ,IC50 值為 30.83 g/mL, 可作為天然抗氧化劑被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。2. 普洱茶色素粗提物的不同萃取物對(duì)二種消化酶活性的影響及性質(zhì)分析普洱茶色素粗提物 ( 水提物 ) 依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后制備樣品 ,首次測(cè)定各部分樣品對(duì) - 葡萄糖苷酶和胰脂肪酶二種消化酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)各部分樣品對(duì) - 葡萄糖苷酶活性的影響程度不同, 三氯甲烷層有輕微的激活作用 , 激活率為對(duì)照的 8.33%, 而水提物、乙酸乙酯萃取層、正丁醇萃取層及水層有顯著的抑制作用 , 抑制率依次為 52.2

4、9%、82.52%、65.84%、 58.22%。各部分樣品對(duì)胰脂肪酶活性均有抑制作用, 三氯甲烷萃取層、乙酸乙酯萃取層、正丁醇萃取層、水層及水提物的抑制率依次為1.80%、13.65%、4.57%、7.55%、9.00%。在相同條件下對(duì)各萃取層進(jìn)行色差參數(shù)測(cè)定、紫外 - 可見(jiàn)光譜掃描、 傅立葉紅外光譜掃描和ACQUITYUPLC-XevoQTof MS分析 , 結(jié)果表明 , 各萃取層內(nèi)在的化學(xué)成分在質(zhì)和量上存在差異, 從而決定了各萃取層對(duì)二種消化酶活性有不同影響。3. 普洱茶水溶性色素的分級(jí)、 性質(zhì)及活性篩選研究首次采用羥丙基葡聚糖凝膠 (Sephadex LH-20) 柱層析對(duì)水溶性色素進(jìn)

5、行分級(jí)研究 , 以丙酮 - 水溶液進(jìn)行洗脫 , 按照色素條帶分別收集得到級(jí)分 , 并進(jìn)一步研究它們的理化與光譜性質(zhì) , 及對(duì) - 葡萄糖苷酶和胰脂肪酶二種消化酶活性的抑制作用。結(jié)果表明, 以 40%丙酮 -水溶液為洗脫劑 , 流速為 0.05 BV/h時(shí), 水溶性色素的分級(jí)效果最好, 柱中呈現(xiàn) 6條明顯的條帶 , 它們的色差參數(shù)值、還原力、pH值、常規(guī)成分含量、穩(wěn)定性、SHIMADZU UV-2550紫外 - 可見(jiàn)分光光度掃描圖、 SHIMADZU FTIR-8400S傅立葉變換紅外光譜掃描圖及ACQUITY UPLC-Xevo QTof MS分析結(jié)果等存在差異 , 進(jìn)一步表征了普洱茶水溶性色

6、素組成與性質(zhì)的復(fù)雜性。研究還表明 , 水溶性色素的各級(jí)分對(duì) - 葡萄糖苷酶和胰脂肪酶二種消化酶活性均有抑制作用 , 其中以級(jí)分五的抑制效果最好。 4. 級(jí)分五對(duì) 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖、分化及分化中相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響以10 g/mL、 20g/mL、30g/mL、50 g/mL 和 100g/mL 級(jí)分五分別處理3T3-L1 前脂肪細(xì)胞 24 h, 能輕微地抑制細(xì)胞的增殖 , 與正常對(duì)照組比較差異不明顯；處理48 h, 上述各濃度對(duì)細(xì)胞的增殖均有抑制作用, 與正常對(duì)照組比較 ,20 g/mL 和 30 g/mL 處理組達(dá)到顯著差異水平 (P<0.05),50g/mL 和 1

7、00g/mL 處理組達(dá)到極顯著差異水平 (P<0.01)；處理 72 h, 各濃度對(duì)細(xì)胞的增殖均有抑制作用, 與正常對(duì)照組比較 ,30 g/mL 和 100 g/mL 處理組達(dá)到顯著差異水平(P<0.05),其它處理組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以 10g/mL、20 g/mL、30g/mL、50g/L 和 100 g/mL 的級(jí)分五分別處理匯合后 ( 約 70%)的 3T3-Ll 前脂肪細(xì)胞 48 h, 均能增加活性氧的含量 , 其中以 30 g/L 處理組中活性氧含量最高 , 并且 20 g/mL、30 g/mL、50g/L 和 100 g/L處理組與對(duì)照組比較均達(dá)到極顯著差異水平(p<0.01)。級(jí)分五抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧增加可能是其“減肥”機(jī)制之一, 通過(guò)“減肥”來(lái)改善 IR 。10 g/mL、20 g/mL、30g/mL、50g/mL 和 100g/mL 級(jí)分五均對(duì) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的脂質(zhì)集聚有明顯的促進(jìn)作用( 與正常對(duì)照組比較P<0.01),且成量效關(guān)系 , 但脂質(zhì)集聚效應(yīng)低于羅格列酮組。 與正常對(duì)照組比較 ,在以 50g/mL 級(jí)分五刺激 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中 , 能明顯下調(diào) PPARy2.C/EBPa和 PTP1B mRNA及其蛋白質(zhì)的表達(dá) , 上調(diào) GLUT4 mRNA表達(dá)及下調(diào) GLU