HIV檢測及臨床意義【蒼松書屋】

1、HIV檢測及臨床意義,中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院 艾滋病確認(rèn)實驗室 尚 紅,1,技術(shù)研究,HIV的發(fā)現(xiàn),Montagnie (LAS) 1983. Science 220: 868-871 Gallo (HTLV) 1983. Science 220: 865-86 Levy (ARV) 1984. Science 225: 840-842 1986 國際病毒分類委員會： HIV HIV-2 1986 西非,2,技術(shù)研究,中國每年新發(fā)現(xiàn)的HIV/AIDS病例數(shù)（19852002,3,技術(shù)研究,HIV感染可通過兩種途徑檢測,直接檢測病毒或其組成部分 檢測人體HIV免疫反應(yīng)HIV特異性抗體 從感染到血清

2、抗體陽轉(zhuǎn)有一段窗口期，平均為1-3個月，有一小部分HIV感染者出現(xiàn)延遲反應(yīng),4,技術(shù)研究,HIV感染后抗原和抗體的變化及其與疾病關(guān)系,HIV感染人體后出現(xiàn)一過性病毒血癥，6-8周后血清抗體陽轉(zhuǎn)，病毒滴度降低，在隨后的5-8年無癥狀帶毒期里HIV抗體一直存在，但病毒難查到。進(jìn)入AIDS期后血漿中病毒再次出現(xiàn)。 故診斷HIV感染多數(shù)時間用抗體檢測診斷，極早期（窗口期）用抗原檢測,5,技術(shù)研究,HIV抗體診斷,目前臨床上實際應(yīng)用的是測定特異性HIV抗體，包括初篩和確認(rèn)實驗,6,技術(shù)研究,一、檢測試劑,篩查試劑必須是HIV-1/2混合型、經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)、批批檢合格、臨床評估質(zhì)量優(yōu)良、在有

3、效期內(nèi)的試劑。 目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集和其它快速診斷試劑。采供血機構(gòu)進(jìn)行血液篩查應(yīng)采用酶聯(lián)免疫試劑。 自采自供血的單位必須進(jìn)行HIV抗體檢測，在尚未建立艾滋病篩查實驗室的偏遠(yuǎn)地區(qū)可由經(jīng)過培訓(xùn)的技術(shù)人員在規(guī)定的場所用快速試劑進(jìn)行血液篩查,7,技術(shù)研究,2、確認(rèn)試劑必須經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)。確認(rèn)試劑包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗及免疫熒光試驗試劑。目前以免疫印跡試劑最為常用,8,技術(shù)研究,ELISA方法： 目前最常用的初篩實驗，自1985年首次檢測HIV-1抗體的試劑盒供市以來，已從第一代的全病毒抗原間接法發(fā)展到第四代的以重組的多肽抗原及抗P24抗體包被的雙夾心法，使窗口期

4、縮短了2-3周,9,技術(shù)研究,四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較,第四代,病毒裂解液 重組抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab,IgM / IgG 抗體 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原,病毒裂解液 重組抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗體,10,技術(shù)研究,Closing the window,第一代試劑檢測IgG抗體，第三代試劑檢測IgG 、IgM抗體, 第四代試劑同時檢測IgG、 IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短,11,技術(shù)研究,檢測結(jié)果的報告和處理 陰性反應(yīng)出具HIV抗體陰性報告， 如果近期有高危行為，如性亂、注射毒品等，

5、或有急性流感樣癥狀等情況，為排除“窗口期”的可能，可以進(jìn)行HIV-1 P24抗原或HIV核酸檢測，或23個月以后再做抗體檢測。 篩查實驗呈陽性發(fā)現(xiàn)反應(yīng)，可出具“HIV抗體待復(fù)查”的報告，不能出陽性報告,12,技術(shù)研究,HIV抗體初篩檢測流程圖,13,技術(shù)研究,快速診斷試劑： 采用乳膠凝集、免疫斑點和免疫層析三種原理 快速、不需特殊儀器 敏感度、特異度低于ELISA，且價格貴 適用于血站覆蓋不到的邊遠(yuǎn)地區(qū)/城市大醫(yī)院急診手術(shù)前檢查 快速診斷陽性結(jié)果還需經(jīng)ELISA方法驗證,14,技術(shù)研究,HIV抗體確認(rèn),常用的確認(rèn)實驗方法是免疫印跡法（WB）。 免疫印跡試劑有HIV-1/2混合型和單一型。一般先

6、用HIV-1/2混合型試劑進(jìn)行檢測,15,技術(shù)研究,蛋白印跡實驗（WB） 廣泛使用的確認(rèn)實驗 用聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化的HIV蛋白抗原分開后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。標(biāo)本中存在的HIV抗體與條帶上的抗原結(jié)合，再加入酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體和底物，在抗原抗體結(jié)合的部位會出現(xiàn)有色條帶 其可檢測標(biāo)本中針對HIV不同抗原的抗體，故被用做確認(rèn)試劑。 不同的研究機構(gòu)有不同的判定標(biāo)準(zhǔn),16,技術(shù)研究,WB結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),不確定”()：出現(xiàn)HIV-1特異性條帶，但帶型不足以 確認(rèn)陽性，每三個月隨訪一次，共兩次， 仍屬可疑，判為陰性,17,技術(shù)研究,18,技術(shù)研究,HIV抗體確認(rèn)檢測流程圖,免疫印跡法(HIV1/2混合

7、型,HIV-1陽性反應(yīng),可疑反應(yīng),出現(xiàn)HIV-2指帶,HIV-1陽性報告,可疑反應(yīng),陽性反應(yīng),陰性反應(yīng),報告HIV-2血清學(xué)陽性反應(yīng)報告必要時測核酸,陰性報告,免疫印跡法（HIV-2,每3個月隨訪一次，共2次，仍屬可疑，則作陰性報告如隨訪期間出現(xiàn)陽性反應(yīng)則報告陽性,陰性反應(yīng),陰性報告,19,技術(shù)研究,P24抗原測定 （一）適用范圍,HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷。 HIV-1陽性母親所生嬰兒的鑒別診斷。 第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應(yīng)， 但HIV-1抗體確認(rèn)陰性者的診斷。 監(jiān)測病程進(jìn)展和抗病毒治療效果,20,技術(shù)研究,三）結(jié)果報告和解釋,1、HIV-1 P24抗

8、原的陽性結(jié)果必須經(jīng)過中和試驗確認(rèn)。 2、HIV-1 P24抗原陽性僅作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)，不能依此確診。 3、HIV-1 P24抗原陰性結(jié)果只表示在本試驗中無反應(yīng)，不能排除HIV感染,21,技術(shù)研究,HIV核酸檢測,22,技術(shù)研究,1、輔助診斷 某些非典型的抗體反應(yīng)，特別是不確定反應(yīng)時，RNA的測定可提供非常有用的證據(jù)。 單純使用RNA測定不能完全確定感染與否，但當(dāng)RNA測定出現(xiàn)較高拷貝數(shù)的陽性結(jié)果時（1000）提示感染發(fā)生的可能性非常大。 使用此指標(biāo)應(yīng)綜合其他檢測數(shù)據(jù)和樣品背景情況進(jìn)行綜合分析與判斷,23,技術(shù)研究,2、窗口期輔助診斷,在窗口期抗原峰出現(xiàn)前后通常出現(xiàn)一個病毒載量的高峰

9、，通常此高峰高于發(fā)病時的血漿病毒水平，早期病毒RNA測定具有特殊的意義。 目前國際上正在嘗試使用這種檢測對采供血樣品進(jìn)行多個樣品混合后的RNA檢測以降低窗口期傳播的殘余危險度,24,技術(shù)研究,3、病程監(jiān)控,由于HIV感染發(fā)生后病毒載量的變化具有一定規(guī)律，并且這種變化與疾病的進(jìn)程有著密切的相關(guān)性。 通常在感染后無癥狀期內(nèi)發(fā)生的臨床癥狀很難與AIDS發(fā)病時的癥狀區(qū)別，病毒載量測定可以幫助醫(yī)生判斷一個剛發(fā)生的癥狀是否與HIV感染有關(guān),25,技術(shù)研究,4、指導(dǎo)治療方案及療效測定,并非在任何情況下感染者都應(yīng)該進(jìn)行抗病毒治療，這不但是經(jīng)濟(jì)上的原因，更重要的是在于抗病毒藥物的副作用和療效。通常在病毒載量達(dá)到

10、一定水平后（如35000-50000拷貝/毫升）才具有良好的效果。 只有通過治療后病毒水平的檢測才能確定治療是否有效，通常治療后病毒水平降低50%才被認(rèn)為臨床有效,通過監(jiān)測病毒滴度反映療效,26,技術(shù)研究,5、預(yù)測疾病進(jìn)程,HIV疾病進(jìn)程與病毒載量的關(guān)系十分密切，觀察感染者病毒RNA水平可大致預(yù)測其發(fā)病的可能。如右圖所示，病毒載量與6年發(fā)病率的關(guān)系為： 30000時則為80,27,技術(shù)研究,定性檢測,HIV核酸檢測有定性和定量兩類，定性檢測用于HIV感染的輔助診斷。通常使用PCR或RT-PCR技術(shù)，使用分子生物學(xué)實驗室通用的擴(kuò)增試劑，引物可來自文獻(xiàn)或自行設(shè)計，應(yīng)盡量涵蓋所有的或常見的毒株，也可

11、使用復(fù)合引物,28,技術(shù)研究,定量檢測,定量檢測常用于監(jiān)測HIV感染者的病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。目前常用的HIV RNA定量測定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗（RT-PCR）、核酸序列擴(kuò)增實驗（NASBA）、分支DNA雜交實驗（bDNA）等，這幾種進(jìn)口試劑盒的最低檢測限為20-50拷貝/毫升 按照儀器讀數(shù)報告結(jié)果，應(yīng)注明使用的試驗方法、樣品種類和樣品量。 測定結(jié)果小于最低檢測限時，應(yīng)注明最低檢測限水平。注意低于最低檢測限的結(jié)果不能排除HIV感染。 應(yīng)附上儀器打印的數(shù)據(jù),29,技術(shù)研究,各種HIV定量檢測方法的比較,30,技術(shù)研究,關(guān)于不同HIV定量檢測方法的選擇,目前用于統(tǒng)一不同定量方法檢測值的標(biāo)準(zhǔn)

12、品還沒有問世 不同定量方法結(jié)果之間還無法直接比較 同一病人治療前后建議用同一方法進(jìn)行HIV定量檢測,31,技術(shù)研究,艾滋病免疫指標(biāo)的檢測,32,技術(shù)研究,隨著政府加速對國產(chǎn)抗艾滋病藥物上市的批準(zhǔn)，我國艾滋病人的治療已經(jīng)出現(xiàn)了曙光。 艾滋病臨床治療中各種免疫指標(biāo)(CD4+、CD8+T細(xì)胞 等)對于確定感染狀態(tài)、預(yù)測發(fā)病、評價藥物療效及新藥開發(fā)具有重要的作用,33,技術(shù)研究,CD4 T淋巴細(xì)胞：（流式細(xì)胞術(shù)） CD4 T細(xì)胞是HIV的主要靶細(xì)胞,感染后隨著病程進(jìn)展，CD4 T細(xì)胞不斷下降 500/mm3有臨床診斷意義 200/mm3AIDS CDC 病程進(jìn)展， AIDS診斷和療效觀察的指標(biāo),34,

13、技術(shù)研究,HIV感染幾周內(nèi)，出現(xiàn)類流感癥狀，也稱為血清陽轉(zhuǎn)期， CD4細(xì)胞的數(shù)量降低。隨之出現(xiàn)的免疫應(yīng)答可以控制急性癥狀，恢復(fù)CD4細(xì)胞的數(shù)量，但并不能清除病毒。隨著CD4細(xì)胞不斷下降，當(dāng)降至500/ul左右時，開始出現(xiàn)機會性感染或其它疾病，進(jìn)入癥狀期。當(dāng)CD4低于200/ul時，即進(jìn)入艾滋病期,35,技術(shù)研究,CD4+T淋巴細(xì)胞小于350/ul（結(jié)合病毒載量，確定治療時機,有效,HIV感染,36,技術(shù)研究,病毒變異和耐藥性的測定,隨著HAART治療的廣泛開展，病毒變異和耐藥株正在不斷出現(xiàn)，甚至對一個藥物的耐藥可引起多種藥物的交叉耐藥。 因此近年來各國相繼建立起病毒變異和耐藥的測試方法，包括基因型HIV耐藥測試和表型HIV耐藥測試,37,技術(shù)研究,表型HIV耐藥性測試方法,能直接測出HIV-1對藥物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐藥情況，有利于指導(dǎo)HIV-1感染者有效地用藥。 目前市面上供應(yīng)試劑盒已有2種，即AV（Vicro Antivirogram）和PS（Virologic PhenoSense），兩者方法均應(yīng)用從生長于載體中的HIV-1而獲得的重組病毒和病人標(biāo)本中蛋白酶與逆轉(zhuǎn)錄酶序列，分析與野病毒之間IC50值相差倍數(shù)，一般達(dá)510倍以上為陽性。 這種方法的最大優(yōu)點是可以獲得各種藥物耐藥量度數(shù)據(jù)，但不足的是試驗慢又昂貴，技術(shù)要求高,38,技術(shù)研