RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟

1、RT-PCR 實(shí)驗(yàn)有三步：抽提RNA ，RT，PCR。要求：1.做 RT前必需測(cè) RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì) RNA 量還是有一些要求，常用 500ng 或 1ug 。2. RT 按要求做，一般不會(huì)出太大問(wèn)題。3. PCR，按常規(guī)。但如需擴(kuò)長(zhǎng)片段，則對(duì)前兩步要求較高，需要有完整的 cDNA 存在，不是單改變 Mg2+ 濃度、退火溫度能解決的。1）RT 和 PCR 時(shí)的引物設(shè)計(jì)是不是一定要先知道目的基因的序列？必須在 RT 時(shí)，引物設(shè)計(jì)有 3 種方法即 a：Random 9mers ；b ：OligodT-AdaptorPrimer ；和c：特異的下游引物。如果用a 和 b 方法，是擴(kuò)增的所有的

2、cDNA（理論上），還要用此產(chǎn)物做PCR的模板繼續(xù)擴(kuò)增。如果用 c 方法，那么要去那里查它的序列呢？問(wèn)題：在做 RT-PCR 遇到一怪現(xiàn)象，即對(duì)同一動(dòng)物不同組織擴(kuò)增同一段基因，結(jié)果從一種組織中可以擴(kuò)出我的目的基因， 條帶非常的好， 而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶， 嘗試其他條件同樣無(wú)法得到滿(mǎn)意的結(jié)果，百思不得其解?。ㄗⅲ阂芽隙ㄔ摶蛟趦煞N組織中都表達(dá)，且內(nèi)參照在兩種組織都可擴(kuò)增出來(lái)）從這兩種組織中提取的RNA 的量是不一樣的，我測(cè)過(guò)吸光度，差異還很大，會(huì)不會(huì)和這有關(guān)呢？請(qǐng)高手指教！解答：1.RT-PCR 有兩種做法：條件具備的話(huà)可用kit 進(jìn)行一步法進(jìn)行；若條件不太好的話(huà)可分

3、兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來(lái)發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強(qiáng)且無(wú)拖尾現(xiàn)象，我推測(cè)是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行，當(dāng)然也可能是我買(mǎi)的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR應(yīng)具備的條件高質(zhì)量的 RNA （保留后可做5， 3 RACE）；引物的（最好產(chǎn)物短點(diǎn)）；若涉及粗略定量的話(huà)還應(yīng)考慮RNA 的濃度或是 cDNA 的濃度（如果由內(nèi)標(biāo)分子更好，但我發(fā)現(xiàn)其實(shí)很不容易將RNA 的濃度以及內(nèi)標(biāo)分子的表達(dá)量調(diào)整的完全一樣）；體系的均一性等。3.RACE我做過(guò) RACE（3RACE 是寶生物的 Kit ；5RACE 是 Gibico ），但現(xiàn)在再進(jìn)行另一個(gè)同源基因的3RACE 時(shí)卻怎么

4、也 P 不出來(lái)，這兩個(gè)基因是由同一對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)的，其中一個(gè)已經(jīng)獲得了全序列（ RACE 的方法），而另一個(gè)基因的 3UTR 卻增么也擴(kuò)不出來(lái)，我推測(cè)是不是該基因的 3UTR 太長(zhǎng)的緣故，我都快綠了，有無(wú)RT-PCR 的常用內(nèi)標(biāo) b actin和 GAPDH 的使用有選擇性嗎？比如不同的細(xì)胞，不同的刺激。有關(guān)內(nèi)參：RT-PCR 內(nèi)參照可以在一個(gè)管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開(kāi)兩管，把除了引物之外的mixture統(tǒng)一配，拍照后，算目的基因和內(nèi)參的比值，這就是基因表達(dá)的相對(duì)濃度。問(wèn)：我曾經(jīng)作過(guò)同一管的 PCR，內(nèi)有 actin 和目的基因引物。雖然可見(jiàn)到兩條均一條帶但圖片質(zhì)量不理想（而且酶

5、量、 Mg2+ 加倍）。請(qǐng)教 mxbdna2003 ，你是如何處理同一管的 PCR 的各成分的濃度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess theamount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amou

6、nt just using accurate piptte is wrong. itshoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做 RT，其實(shí)沒(méi)有什么問(wèn)題，不需要 taq 魅加量， taq 酶本來(lái)就是過(guò)量的 - ，（平時(shí)做 pcr 的時(shí)候，完全可以再省一些 taq 酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應(yīng)該都談到了。Mg 就跟不能變了，一變整個(gè)體系就變了。 能看到均一條帶就很好了。關(guān)鍵是摸，十八摸（太少，只爭(zhēng)朝夕，開(kāi)個(gè)玩笑）雖然用不著，但是摸上 3、5 摸總是必要的，首先

7、遙分開(kāi)摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量， 所以我們不建議再同一管中進(jìn)行，因?yàn)檫€有互相競(jìng)爭(zhēng)抑制的問(wèn)題，即使不同基因之間。有關(guān)內(nèi)參的建議：一定要做內(nèi)參的，每一次，我想。不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的電泳可以不一起跑，沒(méi)有關(guān)系，計(jì)算的是相對(duì)表達(dá)程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說(shuō)一邊我得觀點(diǎn)， 1 、半定量和定量 RT-PCR 做的都是基因相對(duì)表達(dá)量， 不是絕對(duì)表達(dá)量， 除非你能準(zhǔn)確知道來(lái)自多少細(xì)胞，但是細(xì)胞還有死的呢。 2、以電泳為基礎(chǔ)的半定量 RT-PCR 本身是不可信的，作為實(shí)驗(yàn)的粗篩是可以的， 但不能作為最終結(jié)果的，3、半定量 RT-PCR 應(yīng)該再兩管中進(jìn)行，除非內(nèi)參

8、基因和目的基因表達(dá)相同，長(zhǎng)度差不多， GC 含量相似，或者實(shí)在窮的要省 PCR 管和taq 。關(guān)于平臺(tái)期和線(xiàn)性期的問(wèn)題，實(shí)際上線(xiàn)性期是指數(shù)期，只不過(guò)碰巧2的冥和 2 的倍數(shù)是相同的。 看上去任何一個(gè)時(shí)期都可以， 實(shí)際上是不對(duì)的，因?yàn)闋可娴矫复賱?dòng)力學(xué)的問(wèn)題，這個(gè)我也不懂，有一些專(zhuān)門(mén)的文章，好像，涉及到很多化學(xué)的東西。我們學(xué)醫(yī)的，也沒(méi)必要知道那些，但是其中主要是因?yàn)槟０逡锩冈虾蚥uffer之間的關(guān)系，這種反應(yīng)單靠改變其中一種成分沒(méi)有用的， 酶一直是過(guò)量， 再加酶也沒(méi)用，引物 ntp 都是這樣。煙鬼正傳，最好選線(xiàn)性期的開(kāi)始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內(nèi)， 所以選一個(gè)這兩種的契合點(diǎn)。 給你一

9、張圖你就明白了，再開(kāi)始的時(shí)候酸的是切線(xiàn)，這圖我在 * 帖過(guò)。關(guān)于引物設(shè)計(jì)，再可能的情況下，除了常規(guī)要求之外，最好兼顧跨內(nèi)含子（不過(guò)，根據(jù)要求，還可以專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)隔內(nèi)含子的，這樣還可以用于基因組 PCR）、長(zhǎng)度小于 500bp 600bp 等等。引物當(dāng)然要設(shè)計(jì)成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺(tái)機(jī)器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個(gè)溫度，這樣任何幾個(gè)都可以拿來(lái)披，也不用查。我反復(fù)說(shuō)過(guò)了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時(shí)候，還沒(méi)發(fā)現(xiàn)呢，跟不要說(shuō)在基因組的位置和序列了，怎么考慮內(nèi)含子的問(wèn)題呢？18s 的引物也和著名的 actin 一樣是設(shè)計(jì)的，只要拿到

10、序列就可以了，但是限制是只能用總RNA 為模板，但是比actin 和 bubulin等可準(zhǔn)多了，更不要說(shuō) GAPDH 這個(gè)破爛了。18s 除了在細(xì)胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于看家基因，所以定量更加準(zhǔn)確，我想，不知對(duì)不對(duì)，請(qǐng)幾位主任和eeflying指教。我認(rèn)為，就像你用某一種東西的數(shù)量去概括，因該選那種多的東西，說(shuō)一座房子是由2000塊磚造成的，比說(shuō)又29 根梁更準(zhǔn)確吧。更不要說(shuō)沒(méi)有看家基因不看家的缺點(diǎn)，因?yàn)樗欠?wù)于整個(gè)基因組表達(dá)譜什么的。PE 有專(zhuān)門(mén)的用于實(shí)時(shí)PCR 的內(nèi)參試劑盒，就是用18s ，不過(guò)我們看懂使用的那條序列，不知有沒(méi)有人用過(guò)，告知其序列和 genbank號(hào)。

11、正好問(wèn)一下，我查了一些序列，一直沒(méi)有去合成，主要是因?yàn)槭稚系腶ctin 的熒光探針還沒(méi)有完，當(dāng)初和成了一堆。有那位高手用過(guò) 18s 的內(nèi)參，請(qǐng)問(wèn)您的序列（我指的是模板的序列） ？原位雜交最好用 RNA 做探針，效果好一些，反正你有錢(qián)賣(mài) roche 的盒子，而且量也能保證，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄過(guò)程嘛，沿著一條線(xiàn)突突地跑就是了。正義反義也容易理清。我覺(jué)得做 RT-PCR 的方法和條件及應(yīng)注意的事項(xiàng)就是那么幾條 ,許多專(zhuān)業(yè)書(shū)都有詳細(xì)的描述 ,但是許多人還是歷經(jīng)多次磨難，有時(shí)就是得不出結(jié)果。因此， 我認(rèn)為因?yàn)槊總€(gè)人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對(duì)不同的人來(lái)說(shuō)還是有他自己的特殊性 ,我的以下經(jīng)歷說(shuō)明：做實(shí)驗(yàn)時(shí)

12、各人的情況不同 ,做不出時(shí)還是要好好動(dòng)一下腦子。記得我開(kāi)始我的 PCR 時(shí)，按常規(guī)方法，提取總后，首先用自己設(shè)計(jì)的下游引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 不斷改變反應(yīng)條件， 進(jìn)行了次均沒(méi)有結(jié)果。后來(lái)考慮到本人的克隆的 PCR 的片斷位于我們實(shí)驗(yàn)另一位同學(xué)克隆的片斷當(dāng)中， 而該同學(xué)已經(jīng)用 RT-PCR 克隆出她的片斷（盡管她用這些產(chǎn)物做模版再進(jìn)行時(shí)也沒(méi)辦法重復(fù)出她的產(chǎn)物），因此，我先用她的引物和條件擴(kuò)增出她的片斷，然后用她的產(chǎn)物作模板 （有點(diǎn)改進(jìn)， 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)換用了 mers 隨機(jī)引物），用我的引進(jìn)物進(jìn)行一般 PCR，終于得到我的產(chǎn)物，測(cè)序結(jié)果完全正確。盡管我的這個(gè)經(jīng)歷別人很人遇到，但足可以說(shuō)明實(shí)驗(yàn)可以有自己的模

13、式， 書(shū)本的知識(shí)和別人的經(jīng)驗(yàn)很重要， 但有時(shí)也不定要受到書(shū)本框框和別人經(jīng)驗(yàn)的限制請(qǐng)問(wèn)：1 引物的特異退火溫度怎樣設(shè)定？可以根據(jù)gc 和 at 含量算出嗎？可以用引物報(bào)告單上的Tm 值嗎？2 PCR 時(shí) 20 微升體系中 cDNA 應(yīng)加多少比較合適？ MgCl2應(yīng)加多少？各個(gè)成分的量有無(wú)確定標(biāo)準(zhǔn)？3 PCR 結(jié)果跑電泳， actin 有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與 cDNA 的量少有關(guān)嗎？ Mg 離子太多是否會(huì)抑制 Taqase 的活性？一般來(lái)說(shuō)引物報(bào)告單傷得是對(duì)的 ,也可以自己算 ,實(shí)際上重要的各條引物一致 ,剩下的可以摸的 .20 中是指體積還是量 ?只要不明顯改變體系的離子強(qiáng)度 ,加

14、 1,2ul 都可以的 .mg 要調(diào)的 ,但我總覺(jué)得沒(méi)有書(shū)里講的那么玄乎 ,我都是常年不變的 .如果內(nèi)參照有 ,目的沒(méi)有 ,至少證明不是 美麗惹 的禍 .原因書(shū)里應(yīng)該都說(shuō)了 .在所有 RNA 實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA 。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶 （RNA 酶）的污染。由于 RNA 酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而 RNA 制劑中只要存在少量的 RNA 酶就會(huì)引起 RNA 在制備與分析過(guò)程中的降解，而所制備的 RNA 的純度和完整性又可直接影響 RNA 分析的結(jié)果，所以 RNA 的制備與分析操作難度極大。在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性 RNA 酶的污染；

15、另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的 RNA 酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的 RNA 酶也會(huì)造成污染。這些外源性的 RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。一、 防止 RNA 酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180 的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿沖洗 （注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可

16、先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2 室溫 10min ，然后用 0.1% DEPC 水沖洗，晾干。4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用 0.1% DEPC，在 37 處理 12hr 以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC 處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22 m 濾膜過(guò)濾除菌。5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。6. 設(shè)置 RNA 操作專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專(zhuān)用。二、常用的 RNA 酶抑制劑1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的 RNA 酶抑制劑。它通過(guò)和 RNA 酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)

17、合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的 RNA 酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使 RNA 酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì) RNA 酶有強(qiáng)烈的變性作用。3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA 酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA 酶的活性。4. RNA 酶的蛋白抑制劑（ RNasin ）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。 RNasin 是 RNA 酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種 RNA 酶結(jié)合，使其失活。5. 其它： SDS、尿素、硅藻土等對(duì) RNA 酶也有一定抑制作用。mRNA 的分離

18、與純化真核細(xì)胞的 mRNA 分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有 5 端帽子結(jié)構(gòu)（m7G ）和 3 端的 Poly(A) 尾巴。絕大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞 mRNA的 3端存在 20-30 個(gè)腺苷酸組成的 Poly（A）尾，通常用 Poly（A+ ）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核 mRNA 的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT ）纖維素或寡聚 （U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。mRNA 的分離方法較多，其中以寡聚（ dT ）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用 mRNA 3 末端含有 Poly （ A+ ）的特點(diǎn)，在 RNA 流經(jīng)寡聚（dT ）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作

19、用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下， mRNA 被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT ）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA 。寡聚 (dT) 纖維素柱純化mRNA一、試劑準(zhǔn)備13M 醋酸鈉（ pH 5.2 ）20.1M NaOH31上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl ；1M EDTA（ pH 8.0 ）；0.1%SLS( 十二烷基氨酸鈉。配制時(shí)可先配制 Tris-HCl(pH 7.6) 、NaCl 、EDTA（pH 8.0 ）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至 65 時(shí)，加入經(jīng) 65

20、溫育（30min ）的 10%SLS 至終濃度為 0.1% 。4洗脫緩沖液： 10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5無(wú)水乙醇、 70% 乙醇6DEPC二、操作步驟1將 0.5-1.0g 寡聚（ dT ）- 纖維懸浮于 0.1M 的 NaOH溶液中。2用 DEPC 處理的 1ml 注射器或適當(dāng)?shù)奈埽瑢⒐丫郏╠T ）- 纖維素裝柱 0.5-1ml ，用 3 倍柱床體積的 DEPC H2O 洗柱。3使用 1 上樣緩沖液洗柱，直至洗出液 pH 值小于 8.0。4將 RNA 溶解于 DEPC H2O 中，在 65 中溫育 10min 左右，冷

21、卻至室溫后加入等體 2上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng) RNA 上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用 1上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。5將所有流出液于65 加熱 5min ，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6用 5-10 倍柱床體積的 1上樣緩沖液洗柱，每管 1ml 分部收集， OD260 測(cè)定 RNA 含量。前部分收集管中流出液的 OD260 值很高，其內(nèi)含物為無(wú) Poly(A) 尾的 RNA 。后部分收集管中流出液的 OD260 值很低或無(wú)吸收。7用 2-3 倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫P(yáng)oly(A+)RNA，分部收集，每部分為 1/3-1/2柱體積。8OD260 測(cè)定 Poly(A+)R

22、NA 分布，合并含 Poly(A+)RNA 的收集管，加入 1/10 體積 3M NaAc （pH5.2 ）、2.5 倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻， -20 放置 30min 。94 離心， 10000g 15min ，小心吸棄上清。用 70% 乙醇洗滌沉淀。注意：此時(shí) Poly(A+)RNA 的沉淀往往看不到 。4離心，10000g 5min ，棄上清，室溫晾干。10. 用適量的 DEPC H2O 溶解 RNA 。三、注意事項(xiàng)1整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須防止Rnase 的污染。2步驟（ 4）中將 RNA 溶液置 65 中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNAPo

23、ly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。3十二烷基肌氨酸鈉鹽在18 以下溶解度下降， 會(huì)阻礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，若室溫低于18 最好用 LiCl 替代 NaCl 。4寡聚（ dT ）- 纖維素柱可在4貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用 NaOH 、滅菌ddH2O 、上樣緩沖液洗柱。5一般而言，107 哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取 1-5 g Poly(A+)RNA ，約相當(dāng)于上柱總 RNA 量的 1%-2% 。RNA 酶保護(hù)試驗(yàn) (RNase Protect

24、ion Assay,RPA) 是通過(guò)液相雜交的方式 ,用反義 RNA 探針與樣品雜交，以檢測(cè) RNA 表達(dá)的技術(shù)。與 Northern 雜交和 RT-PCR 比較， RPA 有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1 檢測(cè)靈敏度比Northern雜交高。由于 Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA 將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2 由于 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中效率不均一和反應(yīng) “平臺(tái)”問(wèn)題，基于 PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA 沒(méi)有擴(kuò)增過(guò)程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。3 由于與反義 RNA 探針雜交的樣品RNA 僅為該 RNA 分子的

25、部分片段，因此，部分降解的RNA 樣品仍可進(jìn)行分析。4 步驟較少，耗時(shí)短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過(guò)程。5 RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無(wú)探針自身復(fù)性問(wèn)題，無(wú)須封閉。6 一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交，無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性問(wèn)題。7 檢測(cè)分子長(zhǎng)度可以任意設(shè)置，靈活性大。RPA 的缺點(diǎn)是需要同位素標(biāo)記探針。一、試劑準(zhǔn)備1 GACU POOL ：取 100mM ATP 、CTP、GTP 各 2.78 l、100mM UTP 0.06 l，加 DEPC H2O 至 100 l。2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g 、0.5M EDTA （pH8.0 ）20 l、5M NaCl 0

26、.8ml 、甲酰胺 8ml ，加 DEPC H2O 至 10ml 。3. RNase消化液：5M NaCl 120l、1M Tris-HCl(pH7.4) 20l、0.5MEDTA（pH8.0）20 l、RNase A(10mg/ml) 8l、RNase T1(250U/l) 1 l，加DEPC H2O至2ml二、操作步驟1反義 RNA 可由含 T7 或 SP6 啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動(dòng)子的PCR 產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。（1）設(shè)計(jì)含 T7 啟動(dòng)子的 PCR 引物由于 PCR 產(chǎn)物將作為合成反義RNA 的模板，所以一對(duì)引物中的下游引物 5- 端要含 T7 啟動(dòng)子序列 :

27、T7 啟動(dòng)子序列為： 5 -TAATACGACTCACTATAGGG引物設(shè)計(jì)的其他要求與一般 PCR 引物的設(shè)計(jì)相同。 PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度決定了反義 RNA 探針的長(zhǎng)度，具體設(shè)計(jì)時(shí)可考慮 100-400bp 長(zhǎng)。最好采用巢式 PCR，即先擴(kuò)增出一較長(zhǎng)的片段，再以該片段為模板擴(kuò)增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：上游引物下游引物T7 啟動(dòng)子序列下游引物（ 2）PCR先用上游引物和下游引物進(jìn)行 PCR，再以 PCR 產(chǎn)物為模板 ,用上游引物和下游引物 -T7 進(jìn)行二次 PCR(具體操作參見(jiàn) PCR 章節(jié) )。（3）探針合成標(biāo)記與純化在 0.5ml離心管中加入下列試劑：RNasin（40

28、U/ l） 0.5 lGACU POOL GAC（含 GTP、CTP、ATP 各 2.75 mM,UTP 61M ） 2l -32PUTP(10 Ci/ l) 2.5 lDTT ( 二硫蘇糖醇， 0.1M) 1 l5轉(zhuǎn)錄 buffer 2 l模板（ 50ng/ l） 1lT7 RNA聚合酶(15U) 1 l混合后，短暫離心， 37OC 保溫 1hr 。加入滅活DNase DNAse（10U/ l）1 l, 37OC 15min,和 T7 RNA聚合酶。然后75 OC 10min以加入：飽和酚50 l氯仿 50 l酵母 tRNA （2 g/ l） 4 lDEPC H2O 100 l室溫下充分混勻

29、，離心 10000g 2min 。取上層液置另一 0.5 ml 離心管中，加入 100 l 氯仿，混勻，離心 10000g 2min 。將上層液轉(zhuǎn)移至另一 0.5ml 離心管中，再加入 3M NaAc 10 l、預(yù)冷無(wú)水乙醇250 l，混勻后， -20OC 靜置 30min 。4OC 離心 13500g 10min 。棄上清液，沉淀用 75% 乙醇 100 l 洗滌，4OC 離心 13500g 2min, 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入 50 l 雜交緩沖液溶解沉淀， 4OC 下保存待用。可用尿素 -聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)探針質(zhì)量。 （參見(jiàn)本節(jié)電泳步驟）。2雜交（1） RNA 提取后溶解在

30、雜交緩沖液中，濃度為1g/ l。（2）取 8l RNA 加入 1-3 l 探針（根據(jù)探針檢測(cè)結(jié)果調(diào)整） 于 0.5ml離心管中。（ 2） 80OC 保溫 2min ，然后 40-45OC 下雜交 12-18hr 。3. 消化(1) 雜交管于 37 OC 保溫 15min ，加入 RNase 消化液， 37 OC 保溫 30min 。(2) 加入 10%SDS 10 l、10 g/ l 蛋白酶 K 20 l，混勻， 37 OC 保溫 10min 。(3) 加入 65 l 飽和酚和 65 l氯仿，混勻，室溫離心，10000g 2min 。(4) 轉(zhuǎn)移上層液到另一 0.5 離心管中，加入 10 l

31、酵母 tRNA 和 3MNaAc 15 l，再加入 200 l 異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心 ,135000g 10min 。(5) 棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8 l 上樣緩沖液溶解沉淀。4、電泳與放射自顯影（ 1）配制凝膠： (50ml)40% 丙烯酰胺 -亞甲雙丙烯酰胺（ 19 ：1） 6.25ml5TBE 10ml尿素 24g加 H2O 至 50ml溶解后加入 25% 過(guò)硫酸胺 50 l，TEMED 50 l，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。（2）預(yù)電泳以 1TBE 為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進(jìn)行預(yù)電泳，如果用測(cè)序電泳裝置，電壓應(yīng)達(dá) 2000v

32、 以上，功率設(shè)定為 100w ，溫度設(shè)為50 OC 。待膠板溫度達(dá)50 OC 時(shí)，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣。（3）加樣將已溶解在加樣緩沖液中的樣品 80 OC 加熱 2min ，立即加樣到膠孔中，電泳 1-2hr 。（電泳條件同預(yù)電泳）。（ 3） 電泳結(jié)束后，打開(kāi)膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張 X 片，蓋上暗盒， -70OC 曝光1-3 天。暴光結(jié)束后，將X 光片顯影、定影、水洗、晾干。三、注意事項(xiàng)1本實(shí)驗(yàn)大部分為RNA 操作，注意 RNA 酶的污染。2RNase 消化液消化未雜交的單鏈 RNA 和探針 RNA ，當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯(cuò)配時(shí)， 錯(cuò)配位點(diǎn)也將被

33、消化， 因此會(huì)產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進(jìn)行 PCR 時(shí)，采取盡量減少錯(cuò)配的措施。3、 同位素對(duì) RNA 合成有一定影響，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生非全長(zhǎng)的探針。因此，標(biāo)記時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。4、 RNase 消化液有時(shí)會(huì)產(chǎn)生過(guò)度消化而無(wú)檢測(cè)信號(hào)，可以將消化液稀釋 10-100倍后使用?？赡軉?wèn)題出在標(biāo)本的保存：一般四小時(shí)之內(nèi)就應(yīng)處理，分離出細(xì)胞說(shuō)的是套式 PCR,可以在你的第一次 PCR 兩個(gè)引物內(nèi) ,再設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行第二次 PCR 就行了如果你的第一次 PCR 剛好包括目的片段 ,那只好設(shè)計(jì)個(gè)更長(zhǎng)的了第二次的引物設(shè)計(jì)要求可以低一點(diǎn)以 50 l 體系為例引物各 1l第一次 PCR 產(chǎn)物 5l二次 PCR 和巢式

34、 PCR，即設(shè)計(jì)兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，不是一個(gè)概念，它是拿第一次的 PCR 產(chǎn)物，稀釋 100-1000 倍做模板，加入底物，從新進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以期增加產(chǎn)物的量我做 RT-PCR 時(shí),提總 RNA 時(shí),都是用滅菌 DEPC 水,按 1:100 稀釋后測(cè) OD260 和 OD280, 后根據(jù)公式 :RNA 濃度 =OD260* 稀釋度/25(ug/ul),后用 1mg total RNA分離 mRNA. 做逆轉(zhuǎn)錄及 PCR,效果很好 .luoyu10 wrote:各位大哥：我有一個(gè)問(wèn)題請(qǐng)教， RT-PCR 要求模板 RNA 的 260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會(huì)影響結(jié)果？最低到

35、 1.8 ，最好 2.0 ，我感覺(jué)稍微低一點(diǎn)影響不算太大。問(wèn)：我是的新手，想請(qǐng)教引物如何設(shè)計(jì)？好的引物所具有的令人滿(mǎn)意的特點(diǎn)：* 典型的引物 18 到 24 個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。* 選擇 GC 含量為 40 到 60 或 GC 含量反映模板 GC 含量的引物。* 設(shè)計(jì) 5 端和中間區(qū)為 G 或 C 的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。* 避免引物對(duì) 3 末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形

36、成引物二聚體， 抑制擴(kuò)增。* 避免 3 末端富含 GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后 5 個(gè)核苷中含有 3 個(gè)A 或 T。* 避免 3 末端的錯(cuò)誤配對(duì)。 3 端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列， 這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。目的序列上并不存在的附加序列， 如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列， 可以加入到引物 5 端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物 Tm 值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。有時(shí)候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設(shè)計(jì)。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。 簡(jiǎn)并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為

37、了增加特異性， 可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡(jiǎn)并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。不要在引物的3 端使用簡(jiǎn)并堿基，因?yàn)?3 端最后 3 個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始 PCR。使用較高的引物濃度（ 1 M 到 3M ），因?yàn)樵S多簡(jiǎn)并混合物中的引物不是特異性針對(duì)目的模板?！窘?jīng)驗(yàn)】如何確認(rèn)RNA 的質(zhì)量各位都知道，提取到質(zhì)量良好的 RNA （包括總 RNA 和 mRNA ，以下同）是非常困難，關(guān)于 RNA 的提取技術(shù)，我就不說(shuō)了，為什么呢？或許各位非常關(guān)心呢， 我是這樣想的， 我可以看到的資料或者是廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)，各位也同樣可以看到的，內(nèi)容當(dāng)然都是一樣的了，所以實(shí)驗(yàn)做的好不好， 主要是心的投入多少的問(wèn)題， 所以希望大家自己多多思考??！以