Western-Blot顯色篇

1、Western Blot顯色篇WB蛋白印跡在生物化學(xué)這一塊是常規(guī)實驗，就像有人說炒菜中境界最高也最難的是蛋炒飯一樣， 實驗中常規(guī)實驗也是很考驗技能的，除了潛心研究原理、認(rèn)真揣摩技巧以外，對于新實驗試劑的信息把握， 勇于嘗試新方法也是非常之重要的各大廠家都在不斷開發(fā)更方便更靈敏的新產(chǎn)品，“ idea 是生產(chǎn)力”嘛，因此生物通這里介紹一些能把我們從日常操作中解脫出來，獲得“升級版”效果WB產(chǎn)品。講完了 Western Blotting的電泳轉(zhuǎn)移儀器，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和轉(zhuǎn)移膜之后，我們最后來探討一下 WB的檢測系統(tǒng)。一般的 WB檢測過程中，都會有封閉、一抗、 二抗和底物顯色這四道工序要“加工”。 我個

2、人覺得底物顯色這最后一步是最關(guān)鍵的，也是最有文章可以作的一個部分。你看，光標(biāo)記方式就有生物素標(biāo)記，地高辛標(biāo)記，各種酶標(biāo)記等等，酶標(biāo)的底物又有各種生色底物、 化學(xué)發(fā)光法底物和熒光底物可供選擇；就連識別一抗的配體也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，鏈親和素或者Protein A 或 G等，更別說各種試劑盒琳瑯滿目，叫人好像無從下手！不過不急，生物通幫你作個參考，讓你對各種產(chǎn)品的優(yōu)點缺點一覽無遺，真正成為一個WB高手。另外如果實驗室有已經(jīng)建立的固定的顯色方法，那也沒關(guān)系，有時候不經(jīng)意瀏覽到的方法可能就會對你的實驗有莫大的幫助這也就達(dá)到我們的目的了。與蛋白質(zhì)組學(xué)一線專家面對面，趕快報名參加第二

3、期蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與應(yīng)用高級培訓(xùn)班！封閉和一抗的選擇沒有太多的選擇余地封閉前面介紹過了；一抗？現(xiàn)在的抗體產(chǎn)品說明書一般都有注明應(yīng)用范圍的，說明可以用于WB的就 OK。如果沒有這些信息可以遵從以下原則：單抗專一性高，但是經(jīng)過SDS-PAGE變性膠電泳的蛋白質(zhì)可能由于原來的識別位點構(gòu)象發(fā)生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結(jié)果。如果還有多種抗體選擇， 那當(dāng)然是來源于兔或者小鼠抗體為好，因為后繼的檢測試劑盒一般都是針對兔鼠的居多，因而選擇范圍更大通用性也更強(qiáng)。除了無標(biāo)記的一抗，還有生物素等各種標(biāo)記一抗。還聽說有用熒光標(biāo)記的一抗直接檢測而降低背景和非特異結(jié)合，不過由于少了二抗的級聯(lián)放大信號

4、擴(kuò)增，信號也會比較弱，所以需要選擇熒光信號特別明亮的標(biāo)記（Invitrogen收購了著名的Molecular Probes后有推出Alexa Fluor的抗體標(biāo)記試劑盒，生物通 這里 有詳細(xì)而精彩的介紹，我們就不羅嗦了。畢竟不是WB的主流方法。）一抗的稀釋度通常需要預(yù)實驗摸條件， 可以根據(jù)說明書上建議的 WB稀釋度附近做 2 3 個梯度，如果是用化學(xué)發(fā)光法檢測，由于靈敏度高而建議將稀釋度再放大一些。二級試劑的作用是信號擴(kuò)增，選擇是根據(jù)一抗的標(biāo)記形式而決定的，對于無標(biāo)記的一抗，可以選擇對應(yīng)一抗來源種屬的標(biāo)記二抗，或者更便宜的標(biāo)記蛋白A（來自金黃葡萄球菌 ProteinA 可以高度親和來自人，兔，

5、豚鼠的 IgG ，但對大鼠、山羊和雞的IgG 親和力弱） 。不過，二抗是更可靠的選擇除了要選擇對應(yīng)一抗的來源種屬，也要根據(jù)你準(zhǔn)備采用的檢測方法選擇合適的標(biāo)記。酶促反應(yīng)比同位素安全且快速，已經(jīng)成為Western Blot的主流檢測方法。酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實現(xiàn)不同的顯色方法：化學(xué)發(fā)光Chemiluminescent和底物顯色 Colormetirc/Chromogen ，前者靈敏度很高隨著各大廠家努力開發(fā)研制靈敏度更高的發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光法的靈敏度已經(jīng)達(dá)到pg 級別，甚至還有 Femto 級別的，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。最為大家熟悉當(dāng)數(shù)辣根過氧化物酶H

6、RP（Horseradish Peroxidase，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（ AlkalinePhosphatase ），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、 半乳糖苷酶-Galactosidase。. HRP 辣根過氧化酶是最常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶，由于HRP比活高、特異性更強(qiáng)、分子量?。?40kD）、穩(wěn)定和作用底物范圍廣的優(yōu)點而得到廣泛使用。HRP的底物種類有不少，主要可以分為化學(xué)發(fā)光底物和生色底物2 大類。對于底物的選擇，主要考慮的是靈敏度、背景和使用的方便性和穩(wěn)定性比如底物可溶性高使用就比較方便；對于WB來說產(chǎn)物不可溶有助于信號在原

7、位的積累和結(jié)果的穩(wěn)定（產(chǎn)物可溶的底物更適合于Elisa ）。HRP的生色底物顯色有 DAB， 4-CN ， CN/DAB， AEC和 TMB等（而得到可溶性產(chǎn)物的底物如 OPD， ABTS等則適用于 ELISA）中，與化學(xué)發(fā)光法中的酶促基團(tuán)發(fā)光不同，底物顯色主要是利用底物在有 HRP和過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累這一過程檢測 WB的結(jié)果。底物DAB4-CNAECTMB學(xué)名3,3-diaminobenzidin4-chloro-1-naphthol3-amino-9-et3,3,5,5e tetrahydrochloridehyl carbazoltetramethylbenzi

8、dine分子量214.14178.58210.28240.4穩(wěn)定性好一般避光好靈敏度250pg1ng100pg背景一般低高高終產(chǎn)物不能很好的成像容易成像容易成像成像性顏色褐色介于藍(lán)色與藍(lán)紫色之間（可用棕紅色藍(lán)紫色于 double-staining）毒性有（疑有治癌作用）無有無最熟悉的底物應(yīng)該是33 二氨基聯(lián)苯胺 DAB，DAB可以和 HRP作用形成褐色不溶性產(chǎn)物，靈敏度高，特異性好，缺點就是需要現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色后光照數(shù)小時會褪色，不能永久保存，需要拍照記錄，而且有毒。DAB的選擇有一點小小的技巧 33 二氨基聯(lián)苯胺 4 鹽酸鹽的純品分子量為360.1 ，通常是深棕色粉末，不太好溶于水， 容易得到

9、有色顆粒的溶液而導(dǎo)致膜上的背景，而且價格還被炒得貴；但是如果選擇2 水合 33 二氨基聯(lián)苯胺4 鹽酸鹽（分子量396.14 ）就是白色粉末狀晶體，易溶，溶液無色均勻，量大價格還便宜。DAB還有溶劑形式的，便于使用。由于DAB顯色是褐色，不如4-CN 反差大容易拍照，有的廠家還推出了 DAB+4-CN混合底物，結(jié)合了 DAB靈敏度高和 4-CN背景低，易成像的優(yōu)點，能獲得很好的黑色沉淀成像。 用金屬離子增強(qiáng)信號的DBA顯色試劑靈敏度可以高達(dá) 20pg。TMB的 signal-to-noise 信噪比高，成分安全， 特別合適于靈敏度要求高的 WB，但是也要避免由于靈敏度高而引起的高背景，因此可以相

10、應(yīng)的延長封閉的時間和注意洗滌的次數(shù)； ACE各方面性質(zhì)與 DAB相似，但靈敏度要比 DAB差一點。HRP化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物經(jīng)過多個著名廠家的不斷研究開發(fā)而有了更顯著的改進(jìn)。Luminol是經(jīng)典的HRP化學(xué)發(fā)光底物?；瘜W(xué)發(fā)光底物主要考慮的是：發(fā)光信號強(qiáng)弱發(fā)光信號當(dāng)然越強(qiáng)越好，強(qiáng)發(fā)光信號持續(xù)的時間也是越長越好，還有就是背景低靈敏度高。化學(xué)發(fā)光法由于僅在酶和底物都存在的時候才會發(fā)光，不同于生色反應(yīng)般形成不溶的產(chǎn)物于膜上累積， 所以特別適合同一張膜對不同的目標(biāo)蛋白分別進(jìn)行多次檢測。目前最高檢測靈敏度已經(jīng)達(dá)到低飛克 （ Femto）級別而成為安全且靈敏度最高的WB檢測方法。 隨著Cooled-CCD技術(shù)的

11、發(fā)展，成像系統(tǒng)成本越來越低，因而在現(xiàn)在的實驗室里這些設(shè)備越來越普遍。Cooled-CCD 照相機(jī)與X 膠片相比具有瞬時影像處理、立即輸出、不需要膠片處理裝置及暗室等成本花費(fèi)、可用軟件半定量分析等優(yōu)點，然而，這項技術(shù)應(yīng)用于WB化學(xué)發(fā)光法顯影還要求底物能產(chǎn)生高強(qiáng)度、長持續(xù)時間的信號， 以被照相機(jī)捕獲到。 經(jīng)過各大廠家的不斷開發(fā)，現(xiàn)在的化學(xué)發(fā)光檢測試劑從以前的發(fā)光時間持續(xù)幾十分鐘，到現(xiàn)在多數(shù)試劑可持續(xù)長達(dá)幾個小時到一天， 新的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒很多兼容CCD成像檢測， 如果是實驗室有CCD成像設(shè)備的不妨留意試劑盒是否有這種說明。發(fā)光時間的延長即使對于X 底片的用戶也是好消息因為壓片顯影后如果發(fā)現(xiàn)壓片

12、結(jié)果不理想，還可以多次重復(fù)壓片而不需要重新反應(yīng)。化學(xué)發(fā)光的常見問題主要是抗體濃度過高所以抗體用量要比規(guī)定的稀釋倍數(shù)放大許多，確保 HRP不會過量導(dǎo)致底物過快消耗完而引起結(jié)果不穩(wěn)定。GE Healthcare（原安瑪西亞）的ECL堪稱是經(jīng)典， ECL在許多研究人員心目中的幾乎成為化學(xué)發(fā)光法的代名詞，有時竟然是高品質(zhì)文章的保證之一，可見其經(jīng)典。 后來推出的ECL Plus和ECL Advance不單將檢測靈敏度提高了10 20 倍，發(fā)光時間也長達(dá)24 小時以上，兼容CCD成像系統(tǒng)的檢測，使得ECL系統(tǒng)繼續(xù)領(lǐng)導(dǎo)潮流。前不久GEHealthcare公司在生物通上發(fā)布了ECL全系列的65 折特價優(yōu)惠，價

13、格相當(dāng)吸引，對于ECL的忠實粉絲們實在不該錯過。ECL AdvanceECLECL PlusHighest sensitivity WesternHigh sensitivity WesternRecommendedRoutine Westernblotting primary antibody and/orblotting and chemifluorescentapplicationsblottingtarget is very low abundancedetection on scannersUp to 10 times greater thanUp to 20 times great

14、er thanSensitivityUp to 10-12gECL PlusECLAntibody economyOutstandingGoodVery GoodPrimary antibodyUp to 1:100 000Up to 1:10 000Up to 1:20 000Secondary antibodyUp to 1:500 000Up to 1:15 000Up to 1:200 000Blocking AgentYes-ECL Advance BlockCertain systemsCertain systemsincludedSimple reprobingYesYesYes

15、protocolsEmission duration4-6 h1-2 h24-18 hRecommendedHybond-P or Hybond ECLHybond ECLHybond-PmembraneRecommendedFluorescent Scanner/Hyperfirm ECL/CCDHyperfirm ECL/CCDdetectionHyperfirm ECL/CCD雖然延長信號持續(xù)時間讓研究人員能充分利用成像系統(tǒng)的所有特點，但低極限的靈敏度才是研究者期望的終極目標(biāo)。除了擁有王牌產(chǎn)品ECL的 GE公司，化學(xué)發(fā)光底物方面不得不提到Pierce公司。 Pierce形象廣告十分有趣鮮

16、明：用不同色彩的手掌印來表示Pierce真的很有一手: ）。這家已經(jīng)有半個世紀(jì)歷史、在蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域聲譽(yù)卓著的的公司6 年前與 HyClone 合并，擁有世界上最優(yōu)秀的 HRP化學(xué)發(fā)光底物生產(chǎn)技術(shù)世界上許多知名的化學(xué)發(fā)光底物試劑盒廠商都采用PIERCE提供的化學(xué)發(fā)光底物作為生產(chǎn)原料。其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列，就像印證上面我們提到的選擇顯色系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)一樣，SuperSignal靈敏度高（有10-12 g 級， 10-14 g 級， 10-15 g 級選擇），發(fā)光持久（6-24 小時），可反復(fù)曝光， 穩(wěn)定性好（室溫貯藏6 個月， 4至少是12 個月），節(jié)約抗體 （由于靈敏度

17、高，一抗二抗稀釋倍數(shù)是同類產(chǎn)品的10 倍以上，這對于寶貴一抗來說十分重要）。讓人幾乎無法從中挑出毛病來，如果說有的話， 當(dāng)然就是希望便宜一點，再便宜一點羅。另外需要提醒的是抗體一定要比底物顯色法中稀釋更多倍數(shù)，不然過于靈敏（背景高）可不能怪Supersignal哦，還有記得不能拿疊氮鈉來當(dāng)防腐劑因為疊氮鈉會抑制HRP的作用。除此之外也要注意Pierce提供的溶液要用棕色瓶避光保存。Pierce的很有一手不僅僅于此，還有更好玩的東西不用轉(zhuǎn)膜直接在PAGE膠上做 Western Blot的好東西！ 且看生物通后面慢慢介紹。SuperSignal? West Pico 化學(xué)發(fā)光SuperSignal

18、? West Femto 超靈SuperSignal? West Femto 增強(qiáng)型底物敏型底物底物與 ECL? 系統(tǒng)相比減半的價格、雙適用于 HRP檢測的最靈敏的化延長的信號持續(xù)時間使這種底物主要優(yōu)點倍的信號學(xué)發(fā)光底物用于今天的成像設(shè)備最為理想檢測下限10-12 g10-15 g10-14 g信號持續(xù)時間6-8 小時8 小時24 小時首選檢測方法X 膠片成像設(shè)備或 X 膠片成像設(shè)備或 X 膠片建議一抗稀釋度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建議二抗稀釋度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,

19、000-1:250,000產(chǎn)品保存期室溫 1 年41年或室溫 6 個月室溫 1 年建議印跡膜硝化纖維硝化纖維或 PVDF硝化纖維或 PVDFWestern Blot檢測系統(tǒng)中常用交聯(lián)酶兩大家族中的另外一類就是AP堿性磷酸酶。堿性磷酸酶很早就被用于檢測系統(tǒng)包括固定化抗原（WB）檢測和核酸檢測。但是做過AP實驗的經(jīng)常會遇到膜上顯色背景偏高的問題，所以就WesternBlot本身來說偏愛HRP的要比AP多分子克隆III解釋說由于在我們常用的封閉劑：脫脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，這樣當(dāng)然顯色背景會高。所以分子克隆III推薦的AP適用封閉劑是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lED

20、TA 65 度加熱一小時確保AP失活后再用于封閉。一些研究的樣本自身也含有較高水平的堿性磷酸酶，雖然實驗上很容易實現(xiàn)抑制內(nèi)源AP 影響，但實際上容易被忽略。AP 顯色底物生成的產(chǎn)物主要是藍(lán)紫色，成像性好容易拍照。早些年前，AP檢測的靈敏度比HRP高，但是背景也偏高，整個顯色過程更有“技術(shù)性”，有許多個人技巧在里面，讓人取舍兩難。 如今由于HRP系的化學(xué)發(fā)光底物已經(jīng)不斷改進(jìn)而使得靈敏度不斷提高，化學(xué)發(fā)光顯色上HRP和AP 不相上下，但是生色反應(yīng)來說，AP 顯色的靈敏度還是比一般的HRP顯色底物要高。AP 作為一種經(jīng)典常用的顯色交聯(lián)酶，自有其優(yōu)點，比如AP 的底物顯然更穩(wěn)定，不像 HRP那樣需要新

21、鮮配制的H2O2一類的不穩(wěn)定成分，作為試劑盒可以保存時間更長，也自有一批忠實的”粉絲”（fans ），特別是習(xí)慣用顯色方法檢測WB結(jié)果的。就像HRP可以用于化學(xué)發(fā)光和底物顯色一樣，AP也有這兩種常用的檢測方法的不同底物。AP顯色的靈敏度就已經(jīng)可以達(dá)到低皮克級，前提是封閉要做得好。常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 -Indolyphosphate p-Toluidine Salt)， NBT (Nitro-BlueTetrazolium Chloride)和 INT。與蛋白質(zhì)組學(xué)一線專家面對面，趕快報名參加第二期蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與應(yīng)用高級培訓(xùn)班！BCIPNBTBCIP/NBT

22、BCIP/INT學(xué)名5-Bromo-4-chloro-nitro-blue3-indolyltetrazoliumphosphate,chloridetoluidine salt作用與 O2 反應(yīng)形成沉淀氧化反應(yīng)BCIP 除了可以和 O2氧化反應(yīng)反應(yīng)，也可以用 NBT作為電子受體靈敏度100pg100pg30pg一般沉淀顏色紫色藍(lán)紫色藍(lán)紫色棕紅色用途AP 顯色AP 或者葡糖AP ，原位雜交和免疫AP 和免疫氧化酶組化組化幾乎出顯色劑的廠家都會生產(chǎn)到這幾種底物，比如Roche 的 BCIP 和 INT/BCIP，Pierce的 BCIP/NBT，其中以 BCIP/NBT 靈敏度最高， 顯色也比較

23、銳利，成像性比較好，因此也就最常用到。預(yù)配的即用型顯色底物不存在顆粒性底物，較少產(chǎn)生斑點背景。NEB和Invitrogen也有完整的檢測試劑盒。還有一些比較特殊的各家的“法寶”，這里要拿出來“顯擺顯擺”。比如Pierce公司的 Fast Red 是為 Western 印跡，點印跡和免疫組化過程中檢測 AP而專門設(shè)計的，這種底物產(chǎn)生的是亮紅色沉淀，經(jīng)過優(yōu)化，靈敏度高，其中最有趣之處在于其雙染色的好處： 由于這種亮紅色沉淀可以與不溶的 HRP底物沉淀無論是 NC還是尼龍膜上都能形成醒目的對比，因此可以進(jìn)行兩次顯色，檢測不同的蛋白。但是要注意的是 Fast Red 要比 HRP底物先加，以防背景顏色加深（ Fast Red 可能有毒，小心操作喲）。AP的化學(xué)發(fā)光底物可以說是未來創(chuàng)造 WB化學(xué)酶聯(lián)底物靈敏度“神話”的希望所在由于 AP 在催化脫磷底物方法時轉(zhuǎn)換數(shù)高（轉(zhuǎn)換數(shù)：每秒鐘每個酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的量，是酶效率的一個測量單位） ，可快速產(chǎn)生強(qiáng)信號，因此可以獲得非常漂亮靈敏的 WB結(jié)果，而且不需要像生色底物那樣等待半小時才能看結(jié)果。Invitrogen的 WesternBreeze 就是檢測靈敏度達(dá)到 Femto 飛克級別的 AP 化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒，而且發(fā)光持續(xù)時間長達(dá)5 天！真可謂是AP 發(fā)光顯色中的“恒星”。迅速、安全，靈敏度可比同位素，兼容成像系統(tǒng)，再加