Western-Blot顯色篇

1、Western Blot顯色篇WB蛋白印跡在生物化學這一塊是常規(guī)實驗，就像有人說炒菜中境界最高也最難的是蛋炒飯一樣， 實驗中常規(guī)實驗也是很考驗技能的，除了潛心研究原理、認真揣摩技巧以外，對于新實驗試劑的信息把握， 勇于嘗試新方法也是非常之重要的各大廠家都在不斷開發(fā)更方便更靈敏的新產品，“ idea 是生產力”嘛，因此生物通這里介紹一些能把我們從日常操作中解脫出來，獲得“升級版”效果WB產品。講完了 Western Blotting的電泳轉移儀器，蛋白分子量標準和轉移膜之后，我們最后來探討一下 WB的檢測系統。一般的 WB檢測過程中，都會有封閉、一抗、 二抗和底物顯色這四道工序要“加工”。 我個

2、人覺得底物顯色這最后一步是最關鍵的，也是最有文章可以作的一個部分。你看，光標記方式就有生物素標記，地高辛標記，各種酶標記等等，酶標的底物又有各種生色底物、 化學發(fā)光法底物和熒光底物可供選擇；就連識別一抗的配體也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，鏈親和素或者Protein A 或 G等，更別說各種試劑盒琳瑯滿目，叫人好像無從下手！不過不急，生物通幫你作個參考，讓你對各種產品的優(yōu)點缺點一覽無遺，真正成為一個WB高手。另外如果實驗室有已經建立的固定的顯色方法，那也沒關系，有時候不經意瀏覽到的方法可能就會對你的實驗有莫大的幫助這也就達到我們的目的了。與蛋白質組學一線專家面對面，趕快報名參加第二

3、期蛋白質組學技術與應用高級培訓班！封閉和一抗的選擇沒有太多的選擇余地封閉前面介紹過了；一抗？現在的抗體產品說明書一般都有注明應用范圍的，說明可以用于WB的就 OK。如果沒有這些信息可以遵從以下原則：單抗專一性高，但是經過SDS-PAGE變性膠電泳的蛋白質可能由于原來的識別位點構象發(fā)生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結果。如果還有多種抗體選擇， 那當然是來源于兔或者小鼠抗體為好，因為后繼的檢測試劑盒一般都是針對兔鼠的居多，因而選擇范圍更大通用性也更強。除了無標記的一抗，還有生物素等各種標記一抗。還聽說有用熒光標記的一抗直接檢測而降低背景和非特異結合，不過由于少了二抗的級聯放大信號

4、擴增，信號也會比較弱，所以需要選擇熒光信號特別明亮的標記（Invitrogen收購了著名的Molecular Probes后有推出Alexa Fluor的抗體標記試劑盒，生物通 這里 有詳細而精彩的介紹，我們就不羅嗦了。畢竟不是WB的主流方法。）一抗的稀釋度通常需要預實驗摸條件， 可以根據說明書上建議的 WB稀釋度附近做 2 3 個梯度，如果是用化學發(fā)光法檢測，由于靈敏度高而建議將稀釋度再放大一些。二級試劑的作用是信號擴增，選擇是根據一抗的標記形式而決定的，對于無標記的一抗，可以選擇對應一抗來源種屬的標記二抗，或者更便宜的標記蛋白A（來自金黃葡萄球菌 ProteinA 可以高度親和來自人，兔，

5、豚鼠的 IgG ，但對大鼠、山羊和雞的IgG 親和力弱） 。不過，二抗是更可靠的選擇除了要選擇對應一抗的來源種屬，也要根據你準備采用的檢測方法選擇合適的標記。酶促反應比同位素安全且快速，已經成為Western Blot的主流檢測方法。酶促反應可以搭配不同的底物從而實現不同的顯色方法：化學發(fā)光Chemiluminescent和底物顯色 Colormetirc/Chromogen ，前者靈敏度很高隨著各大廠家努力開發(fā)研制靈敏度更高的發(fā)光底物，化學發(fā)光法的靈敏度已經達到pg 級別，甚至還有 Femto 級別的，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。最為大家熟悉當數辣根過氧化物酶H

6、RP（Horseradish Peroxidase，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（ AlkalinePhosphatase ），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、 半乳糖苷酶-Galactosidase。. HRP 辣根過氧化酶是最常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯酶，由于HRP比活高、特異性更強、分子量?。?40kD）、穩(wěn)定和作用底物范圍廣的優(yōu)點而得到廣泛使用。HRP的底物種類有不少，主要可以分為化學發(fā)光底物和生色底物2 大類。對于底物的選擇，主要考慮的是靈敏度、背景和使用的方便性和穩(wěn)定性比如底物可溶性高使用就比較方便；對于WB來說產物不可溶有助于信號在原

7、位的積累和結果的穩(wěn)定（產物可溶的底物更適合于Elisa ）。HRP的生色底物顯色有 DAB， 4-CN ， CN/DAB， AEC和 TMB等（而得到可溶性產物的底物如 OPD， ABTS等則適用于 ELISA）中，與化學發(fā)光法中的酶促基團發(fā)光不同，底物顯色主要是利用底物在有 HRP和過氧化氫的存在下失去電子而呈現出顏色變化積累這一過程檢測 WB的結果。底物DAB4-CNAECTMB學名3,3-diaminobenzidin4-chloro-1-naphthol3-amino-9-et3,3,5,5e tetrahydrochloridehyl carbazoltetramethylbenzi

8、dine分子量214.14178.58210.28240.4穩(wěn)定性好一般避光好靈敏度250pg1ng100pg背景一般低高高終產物不能很好的成像容易成像容易成像成像性顏色褐色介于藍色與藍紫色之間（可用棕紅色藍紫色于 double-staining）毒性有（疑有治癌作用）無有無最熟悉的底物應該是33 二氨基聯苯胺 DAB，DAB可以和 HRP作用形成褐色不溶性產物，靈敏度高，特異性好，缺點就是需要現配現用，顯色后光照數小時會褪色，不能永久保存，需要拍照記錄，而且有毒。DAB的選擇有一點小小的技巧 33 二氨基聯苯胺 4 鹽酸鹽的純品分子量為360.1 ，通常是深棕色粉末，不太好溶于水， 容易得到

9、有色顆粒的溶液而導致膜上的背景，而且價格還被炒得貴；但是如果選擇2 水合 33 二氨基聯苯胺4 鹽酸鹽（分子量396.14 ）就是白色粉末狀晶體，易溶，溶液無色均勻，量大價格還便宜。DAB還有溶劑形式的，便于使用。由于DAB顯色是褐色，不如4-CN 反差大容易拍照，有的廠家還推出了 DAB+4-CN混合底物，結合了 DAB靈敏度高和 4-CN背景低，易成像的優(yōu)點，能獲得很好的黑色沉淀成像。 用金屬離子增強信號的DBA顯色試劑靈敏度可以高達 20pg。TMB的 signal-to-noise 信噪比高，成分安全， 特別合適于靈敏度要求高的 WB，但是也要避免由于靈敏度高而引起的高背景，因此可以相

10、應的延長封閉的時間和注意洗滌的次數； ACE各方面性質與 DAB相似，但靈敏度要比 DAB差一點。HRP化學發(fā)光反應底物經過多個著名廠家的不斷研究開發(fā)而有了更顯著的改進。Luminol是經典的HRP化學發(fā)光底物?；瘜W發(fā)光底物主要考慮的是：發(fā)光信號強弱發(fā)光信號當然越強越好，強發(fā)光信號持續(xù)的時間也是越長越好，還有就是背景低靈敏度高?；瘜W發(fā)光法由于僅在酶和底物都存在的時候才會發(fā)光，不同于生色反應般形成不溶的產物于膜上累積， 所以特別適合同一張膜對不同的目標蛋白分別進行多次檢測。目前最高檢測靈敏度已經達到低飛克 （ Femto）級別而成為安全且靈敏度最高的WB檢測方法。 隨著Cooled-CCD技術的

11、發(fā)展，成像系統成本越來越低，因而在現在的實驗室里這些設備越來越普遍。Cooled-CCD 照相機與X 膠片相比具有瞬時影像處理、立即輸出、不需要膠片處理裝置及暗室等成本花費、可用軟件半定量分析等優(yōu)點，然而，這項技術應用于WB化學發(fā)光法顯影還要求底物能產生高強度、長持續(xù)時間的信號， 以被照相機捕獲到。 經過各大廠家的不斷開發(fā)，現在的化學發(fā)光檢測試劑從以前的發(fā)光時間持續(xù)幾十分鐘，到現在多數試劑可持續(xù)長達幾個小時到一天， 新的化學發(fā)光檢測試劑盒很多兼容CCD成像檢測， 如果是實驗室有CCD成像設備的不妨留意試劑盒是否有這種說明。發(fā)光時間的延長即使對于X 底片的用戶也是好消息因為壓片顯影后如果發(fā)現壓片

12、結果不理想，還可以多次重復壓片而不需要重新反應。化學發(fā)光的常見問題主要是抗體濃度過高所以抗體用量要比規(guī)定的稀釋倍數放大許多，確保 HRP不會過量導致底物過快消耗完而引起結果不穩(wěn)定。GE Healthcare（原安瑪西亞）的ECL堪稱是經典， ECL在許多研究人員心目中的幾乎成為化學發(fā)光法的代名詞，有時竟然是高品質文章的保證之一，可見其經典。 后來推出的ECL Plus和ECL Advance不單將檢測靈敏度提高了10 20 倍，發(fā)光時間也長達24 小時以上，兼容CCD成像系統的檢測，使得ECL系統繼續(xù)領導潮流。前不久GEHealthcare公司在生物通上發(fā)布了ECL全系列的65 折特價優(yōu)惠，價

13、格相當吸引，對于ECL的忠實粉絲們實在不該錯過。ECL AdvanceECLECL PlusHighest sensitivity WesternHigh sensitivity WesternRecommendedRoutine Westernblotting primary antibody and/orblotting and chemifluorescentapplicationsblottingtarget is very low abundancedetection on scannersUp to 10 times greater thanUp to 20 times great

14、er thanSensitivityUp to 10-12gECL PlusECLAntibody economyOutstandingGoodVery GoodPrimary antibodyUp to 1:100 000Up to 1:10 000Up to 1:20 000Secondary antibodyUp to 1:500 000Up to 1:15 000Up to 1:200 000Blocking AgentYes-ECL Advance BlockCertain systemsCertain systemsincludedSimple reprobingYesYesYes

15、protocolsEmission duration4-6 h1-2 h24-18 hRecommendedHybond-P or Hybond ECLHybond ECLHybond-PmembraneRecommendedFluorescent Scanner/Hyperfirm ECL/CCDHyperfirm ECL/CCDdetectionHyperfirm ECL/CCD雖然延長信號持續(xù)時間讓研究人員能充分利用成像系統的所有特點，但低極限的靈敏度才是研究者期望的終極目標。除了擁有王牌產品ECL的 GE公司，化學發(fā)光底物方面不得不提到Pierce公司。 Pierce形象廣告十分有趣鮮

16、明：用不同色彩的手掌印來表示Pierce真的很有一手: ）。這家已經有半個世紀歷史、在蛋白質化學領域聲譽卓著的的公司6 年前與 HyClone 合并，擁有世界上最優(yōu)秀的 HRP化學發(fā)光底物生產技術世界上許多知名的化學發(fā)光底物試劑盒廠商都采用PIERCE提供的化學發(fā)光底物作為生產原料。其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列，就像印證上面我們提到的選擇顯色系統的標準一樣，SuperSignal靈敏度高（有10-12 g 級， 10-14 g 級， 10-15 g 級選擇），發(fā)光持久（6-24 小時），可反復曝光， 穩(wěn)定性好（室溫貯藏6 個月， 4至少是12 個月），節(jié)約抗體 （由于靈敏度

17、高，一抗二抗稀釋倍數是同類產品的10 倍以上，這對于寶貴一抗來說十分重要）。讓人幾乎無法從中挑出毛病來，如果說有的話， 當然就是希望便宜一點，再便宜一點羅。另外需要提醒的是抗體一定要比底物顯色法中稀釋更多倍數，不然過于靈敏（背景高）可不能怪Supersignal哦，還有記得不能拿疊氮鈉來當防腐劑因為疊氮鈉會抑制HRP的作用。除此之外也要注意Pierce提供的溶液要用棕色瓶避光保存。Pierce的很有一手不僅僅于此，還有更好玩的東西不用轉膜直接在PAGE膠上做 Western Blot的好東西！ 且看生物通后面慢慢介紹。SuperSignal? West Pico 化學發(fā)光SuperSignal

18、? West Femto 超靈SuperSignal? West Femto 增強型底物敏型底物底物與 ECL? 系統相比減半的價格、雙適用于 HRP檢測的最靈敏的化延長的信號持續(xù)時間使這種底物主要優(yōu)點倍的信號學發(fā)光底物用于今天的成像設備最為理想檢測下限10-12 g10-15 g10-14 g信號持續(xù)時間6-8 小時8 小時24 小時首選檢測方法X 膠片成像設備或 X 膠片成像設備或 X 膠片建議一抗稀釋度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建議二抗稀釋度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,

19、000-1:250,000產品保存期室溫 1 年41年或室溫 6 個月室溫 1 年建議印跡膜硝化纖維硝化纖維或 PVDF硝化纖維或 PVDFWestern Blot檢測系統中常用交聯酶兩大家族中的另外一類就是AP堿性磷酸酶。堿性磷酸酶很早就被用于檢測系統包括固定化抗原（WB）檢測和核酸檢測。但是做過AP實驗的經常會遇到膜上顯色背景偏高的問題，所以就WesternBlot本身來說偏愛HRP的要比AP多分子克隆III解釋說由于在我們常用的封閉劑：脫脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，這樣當然顯色背景會高。所以分子克隆III推薦的AP適用封閉劑是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lED

20、TA 65 度加熱一小時確保AP失活后再用于封閉。一些研究的樣本自身也含有較高水平的堿性磷酸酶，雖然實驗上很容易實現抑制內源AP 影響，但實際上容易被忽略。AP 顯色底物生成的產物主要是藍紫色，成像性好容易拍照。早些年前，AP檢測的靈敏度比HRP高，但是背景也偏高，整個顯色過程更有“技術性”，有許多個人技巧在里面，讓人取舍兩難。 如今由于HRP系的化學發(fā)光底物已經不斷改進而使得靈敏度不斷提高，化學發(fā)光顯色上HRP和AP 不相上下，但是生色反應來說，AP 顯色的靈敏度還是比一般的HRP顯色底物要高。AP 作為一種經典常用的顯色交聯酶，自有其優(yōu)點，比如AP 的底物顯然更穩(wěn)定，不像 HRP那樣需要新

21、鮮配制的H2O2一類的不穩(wěn)定成分，作為試劑盒可以保存時間更長，也自有一批忠實的”粉絲”（fans ），特別是習慣用顯色方法檢測WB結果的。就像HRP可以用于化學發(fā)光和底物顯色一樣，AP也有這兩種常用的檢測方法的不同底物。AP顯色的靈敏度就已經可以達到低皮克級，前提是封閉要做得好。常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 -Indolyphosphate p-Toluidine Salt)， NBT (Nitro-BlueTetrazolium Chloride)和 INT。與蛋白質組學一線專家面對面，趕快報名參加第二期蛋白質組學技術與應用高級培訓班！BCIPNBTBCIP/NBT

22、BCIP/INT學名5-Bromo-4-chloro-nitro-blue3-indolyltetrazoliumphosphate,chloridetoluidine salt作用與 O2 反應形成沉淀氧化反應BCIP 除了可以和 O2氧化反應反應，也可以用 NBT作為電子受體靈敏度100pg100pg30pg一般沉淀顏色紫色藍紫色藍紫色棕紅色用途AP 顯色AP 或者葡糖AP ，原位雜交和免疫AP 和免疫氧化酶組化組化幾乎出顯色劑的廠家都會生產到這幾種底物，比如Roche 的 BCIP 和 INT/BCIP，Pierce的 BCIP/NBT，其中以 BCIP/NBT 靈敏度最高， 顯色也比較

23、銳利，成像性比較好，因此也就最常用到。預配的即用型顯色底物不存在顆粒性底物，較少產生斑點背景。NEB和Invitrogen也有完整的檢測試劑盒。還有一些比較特殊的各家的“法寶”，這里要拿出來“顯擺顯擺”。比如Pierce公司的 Fast Red 是為 Western 印跡，點印跡和免疫組化過程中檢測 AP而專門設計的，這種底物產生的是亮紅色沉淀，經過優(yōu)化，靈敏度高，其中最有趣之處在于其雙染色的好處： 由于這種亮紅色沉淀可以與不溶的 HRP底物沉淀無論是 NC還是尼龍膜上都能形成醒目的對比，因此可以進行兩次顯色，檢測不同的蛋白。但是要注意的是 Fast Red 要比 HRP底物先加，以防背景顏色加深（ Fast Red 可能有毒，小心操作喲）。AP的化學發(fā)光底物可以說是未來創(chuàng)造 WB化學酶聯底物靈敏度“神話”的希望所在由于 AP 在催化脫磷底物方法時轉換數高（轉換數：每秒鐘每個酶分子催化底物轉變?yōu)楫a物的量，是酶效率的一個測量單位） ，可快速產生強信號，因此可以獲得非常漂亮靈敏的 WB結果，而且不需要像生色底物那樣等待半小時才能看結果。Invitrogen的 WesternBreeze 就是檢測靈敏度達到 Femto 飛克級別的 AP 化學發(fā)光法檢測試劑盒，而且發(fā)光持續(xù)時間長達5 天！真可謂是AP 發(fā)光顯色中的“恒星”。迅速、安全，靈敏度可比同位素，兼容成像系統，再加