離子交換層析

1、第九章 離子交換層析及凝膠過濾介質(zhì),一、基本原理 離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)(或功能基團(tuán))和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基因以共價鍵連 接，電荷基因與反離子以離子鍵結(jié)合。 離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，假設(shè)以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA+B+ RB+A,離子交換層析 離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。此法廣泛應(yīng)用于很多生化物質(zhì)(例如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、核苷和有機(jī)酸等)的分析、制備、純化，以及溶液的中和、脫色等方面,離子交換色譜中所進(jìn)行的離子交換過

2、程（以陽離子交換樹脂為例,離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強(qiáng)酸性(陽性)離子交換劑對H+的結(jié)合力比對Na+的??；強(qiáng)堿性(陰性)離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對H+的結(jié)合力遠(yuǎn)比對Na+的大；弱堿性離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的大。因此，在應(yīng)用離子交換劑時，采用何種反離子進(jìn)行電荷平衡是決定吸附容量的重要因子之一。離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成的)的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。所以，離子價數(shù)越高，結(jié)合力越大。在離子間電荷相同時，則離子的原子序數(shù)越高

3、，水合離子半徑越小，結(jié)合力亦越大,兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH低于等電點(pI)時，它們帶正電荷能與陽離子交換劑結(jié)合；反之，pH高于pI時，它們帶負(fù)電荷能與陰離子交換劑結(jié)合 。pH與pI的差值越大，帶電量越大，與交換劑的結(jié)合力越強(qiáng)。 離子交換層析之所以能成功地把各種無機(jī)離子、有機(jī)離子或生物大分子物質(zhì)分開，其主要依據(jù)是離子交換劑對各種離子或離子化合物有不同的結(jié)合力,氨基酸的離子交換分離原理,8,What happens in ion exchange,Equilibration,anion e

4、xchange bead,9,What happens in ion exchange,Sample application and wash,10,What happens in ion exchange,Elution,11,What happens in ion exchange,Regeneration,12,What happens in ion exchange,Sample application and wash,Elution,Equilibration,Regeneration,1上樣階段，此時離子交換劑與平衡離子結(jié)合；（平衡 階段） 2吸附階段，混合樣品中的分子與離子交換

5、劑結(jié)合； 3開始解吸階段，雜質(zhì)分子與離子交換劑之間結(jié)合較弱 而先被洗脫，目標(biāo)分子仍處于吸附狀態(tài)； 4完全解吸階段，目標(biāo)分子被洗脫； 5再生階段，用起始緩沖液重新平衡層析柱，以備下次 使用,離子交換層析一般步驟,氨基酸的分離過程,二、離子交換劑的部分性質(zhì) 粒度 基質(zhì)顆粒大小直接關(guān)系到分離效果，顆粒越小，層 析柱的理論塔板數(shù)就越大，分離效果越好，但同時 交換容量變小，層析時背景壓力增大，限制了流速 的提高，因此細(xì)顆粒的介質(zhì)常適用于分析型分離； 相反，基質(zhì)顆粒越大，柱效率會下降，但離子交換 劑的交換容量提高，背景壓力減小，因此大顆粒介 質(zhì)適合于實驗室小規(guī)模分離及大規(guī)模工業(yè)化分離,交聯(lián)度和網(wǎng)孔結(jié)構(gòu) 交

6、聯(lián)度的大小影響著離子交換劑的很多特性，包括機(jī)械強(qiáng)度、膨脹度、網(wǎng)孔大小、交換容量等。 一般交聯(lián)度越高，網(wǎng)孔的孔徑越小；交聯(lián)度越低，網(wǎng)孔孔徑越大。僅瓊脂糖交換劑是例外,交聯(lián)度和網(wǎng)孔結(jié)構(gòu) 分離介質(zhì)的孔有3種結(jié)構(gòu)。第一種通過交聯(lián)使大分子鏈間形成孔，這叫凝膠孔。 第二種在有溶劑存在條件下進(jìn)行聚合，稱為大孔樹脂。 第三種為瓊脂糖介質(zhì)的孔，孔徑大小僅與瓊脂糖濃度有關(guān)，交聯(lián)對孔結(jié)構(gòu)影響不大,電荷密度 電荷密度是指基質(zhì)顆粒上單位表面積的取代基（功能集團(tuán)）的數(shù)量，它決定著離子交換劑的交換容量、膨脹度等性質(zhì)。對小分子進(jìn)行離子交換時，交換劑上功能基團(tuán)密度越大，工作能力越強(qiáng)，高電荷密度的離子交換劑具有優(yōu)勢,膨脹度 又稱

7、吸水值，是指當(dāng)干態(tài)的離子交換劑在 水溶液中吸水后造成體積膨脹的程度，通 常用每克干膠吸水膨脹后的體積（毫升） 來表示,交換容量 交換容量是指離子交換劑能夠結(jié)合溶液中可交換離子的能力，通常分為總交換容量和有效交換容量。 總交換容量用每克干介質(zhì)或每毫升濕膠包含的帶電功能基團(tuán)的數(shù)量來表示.可以通過酸堿滴定的方法來測定，也可使得離子交換劑和某種小的離子之間發(fā)生完全交換，然后通過測定該離子的含量算出總交換容量，總交換容量并不反映交換劑對可交換分子的結(jié)合情況,有效交換容量指每克干介質(zhì)或每毫升濕膠在一定的實驗條件下吸附某種分子的實際容量。由于有效容量是一個變值，在說明其數(shù)值時應(yīng)當(dāng)同時指出實驗條件. 一般情況

8、下，同一種交換劑對于分子量小的蛋白質(zhì)有效交換容量較大，而對于分子量大的蛋白質(zhì)有效容量較?。粚τ谕环N蛋白質(zhì)，離子交換劑的交聯(lián)度越小有效容量越大，而交聯(lián)度越大有效容量越小,二、離子交換劑 離子交換劑應(yīng)滿足的基本條件有： 有高度的不溶性。即在各種溶劑中不發(fā)生溶解； 有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換； 有較多的交換基團(tuán)； 有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。在使用過程中，不因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象,一) 離子交換劑的種類 根據(jù)離子交換劑中基質(zhì)的組成和性質(zhì)，可將其分成兩大類： 1. 疏水性離子交換劑 疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹

9、脂。常用的樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑，能把聚乙烯苯直鏈化合物連接成類似海綿狀的結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)中以共價鍵引入不同的電荷基團(tuán)。離子交換樹脂以電荷基團(tuán)的性質(zhì)分則有：陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂(分別包括強(qiáng)、中、弱三種電荷基團(tuán))和螯合離子交換樹脂(對金屬離子有較強(qiáng)的選擇性,1) 陽離子交換劑 陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。因此，可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反應(yīng)。根據(jù)電荷基團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將陽離子交換劑分為強(qiáng)酸型( 帶磺酸基團(tuán))、中強(qiáng)酸型(帶磷酸基團(tuán)或亞磷酸基團(tuán))和弱酸型(帶羧基的或酚基)三種。 (2) 陰離子交換劑 陰離子交換劑是在樹脂中分別

10、引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺 -NHCH3和伯胺-NH2基團(tuán)構(gòu)成的。當(dāng)引入季胺和叔胺基團(tuán)時，分別為強(qiáng)陰性和中強(qiáng)陰性離子交換劑。當(dāng)引入仲胺和伯胺基團(tuán)時，為弱陰性離子交換劑,樹脂型離子交換劑一般都呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的珠狀體，其大小在20-50目之間。近年Bio-Rad公司還制造了50-100目、100-200目以及200-400目的產(chǎn)品，目數(shù)大的樹脂對提高分辨率和交換容量是有利的。 疏水性的離子交換劑由于含有大量的活性基團(tuán)，交換容量高、機(jī)械強(qiáng)度大、流動速度快。因此，主要用于分離無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質(zhì)，其次可用于從蛋白質(zhì)溶液中除去表面活性劑(如十二烷基硫酸

11、鈉)、清潔劑(如tritonX-100)、尿素、兩性電解質(zhì)(Ampholyte)。此外，還可用于分離某些不易變性的蛋白質(zhì),疏水性的離子交換劑對帶電荷多和疏水性強(qiáng)的被分離物有較強(qiáng)的截留能力,陽離子交換樹脂對氨基酸的分離,2.親水性離子交換劑 這類交換劑與水的親和力較大，載體孔徑大，適合于分離生物大分子，有多種類型： (1) 纖維素離子交換型 以纖維素為基質(zhì)，常用的功能基因有磷酸基(P.中強(qiáng)酸型)、磺酸乙基(SE，強(qiáng)酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，強(qiáng)堿型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱堿型)、氨基乙基(AE，中等堿型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等堿型)等，可制成纖維狀、微

12、粒、短纖維、球形四種類型，Pharmacia (GE)公司生產(chǎn)的DEAE-Sephacel為球形顆粒，機(jī)械性能和理化穩(wěn)定性好，對蛋白質(zhì)、核酸、激素等均有良好的分辨率、回收率和交換容量，使用簡單方便，在生物化學(xué)與分子生物學(xué)中使用普遍。此外，Watman公司的DE-、CM-、P- 、AE-、SE-及QA-纖維素，Bio-Rad公司的CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一些國產(chǎn)的DEAE-纖維素和CM-纖維素也可選擇使用,2) 葡聚糖系離子交換劑 以SephadexG25和G50為基質(zhì)，分別引入DEAE、QAE(二乙基(二羧 丙基)氨基乙基，弱堿型)、CM、SP(磺丙

13、基、強(qiáng)酸型)等功能基因，構(gòu)成8種交換劑，交換容量較離子交換纖維素大，除離子交換作用外，還有分子篩作用，但層析時床體積隨洗脫劑離子強(qiáng)度的增加而縮小，以SephadexG50為基質(zhì)的交換劑尤其明顯，為使用帶來不便,3) 瓊脂糖系列離子交換劑： 以瓊脂糖為基質(zhì)，主要有Pharmacia (GE)公司的Sepharose和Bio-Rad公司的Bio-gel兩個系列。 Sepharose系列離子交換劑：早期產(chǎn)品為DEAE-Sepharose CL-6B和CM-Sepharose CL-6B ，對生物大分子分辨力好，交換容量大，床體積隨洗脫液的離子強(qiáng)度和pH的改變小，使用較 Sephadex系列方便。后續(xù)

14、產(chǎn)品Sepharose Fast Flow(Sepharose FF)理化穩(wěn)定性和機(jī)械性能更好。交換容量大，可以在床清洗，床體積隨pH的離子強(qiáng)度變化很小，由于流速和載量高，適合于進(jìn)行大量粗產(chǎn)品的純化工作。引入的功能機(jī)團(tuán)有Q(強(qiáng)堿性)、SP、DEAE、CM四種。此外，Sepharose High Performnce (Sepharose HP)有Q-Sepharose HP和SP-Sepharose HP兩種，顆粒細(xì)、分辨率高，理化穩(wěn)定性好，流速和載量均適合于實驗室或大量制備使用。 Bio-GelA系離子交換劑：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA兩種，回收率極高，床體積隨pH

15、和離子強(qiáng)度變化小，pH和化學(xué)穩(wěn)定性好,4) Source系列離子交換劑 有Q(強(qiáng)堿型的)和S(強(qiáng)酸型)兩種，是低壓層析系統(tǒng)中分辨率最高，流速最快的離子交換劑，理化穩(wěn)定性極好，可用1mol/L HCl和1mol/L NaOH在床清洗，使用壽命長 ，樣品回收率高，重復(fù)性好，工藝放大容易。 (5) Mono Beads系列離子交換劑 是Pharmacia (GE)公司推出的新型交換劑，以親水性聚醚為基質(zhì) ，能快速分離蛋白質(zhì)，肽和低聚核苷酸，動態(tài)載樣量大，可分離從mg到g的單克隆抗體,二) 離子交換劑的選擇 任何一種離子交換劑都不可能適用于分離所有的樣品。因此，選擇理想的離子交換劑是提高有效成分的得率

16、和分辨率的一個重要環(huán)節(jié)。 1.陰、陽離子交換劑的選擇 如果被分離物質(zhì)帶正電荷，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如果被分離物質(zhì)帶負(fù)電荷，則應(yīng)選擇陰離子交換劑；如果被分離物質(zhì)為兩性離子，要按照其穩(wěn)定狀態(tài)的凈電荷來選擇交換劑。假設(shè)一蛋白質(zhì)的等電點為5，若該物質(zhì)在pH5-8穩(wěn)定時，應(yīng)選擇陰離子交換劑； 若該物質(zhì)在pH5以下穩(wěn)定時，則可選擇陽離子交換劑。 2.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇 一般來說，強(qiáng)離子交換劑適用的pH范圍很廣。所以常用它來制備無離子水和分離一些在極端pH溶液中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)。而弱性離子交換劑適用的pH范圍較窄，在pH為中性的溶液中交換容量也高，用于分離生物大分子物質(zhì)時，其活性不易喪失。所以，分離生

17、物樣品多采用弱離子交換劑,3.反離子的選擇 離子交換劑處于電中性時往往帶有一定的反離子。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。所此，強(qiáng)陽性和強(qiáng)陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型；弱酸性和弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。 4.基質(zhì)的選擇 樹脂基質(zhì)是疏水性化合物，而纖維素、葡聚糖和瓊脂糖基質(zhì)則是親水性化合物。在分離生物大分子時，親水性基質(zhì)交換容量高，且對生物大分子物質(zhì)的吸附和洗脫都比較溫和，被分離物質(zhì)活性不易受到破壞。 要恰當(dāng)?shù)剡x擇離子交換劑，必須對被分離物的性質(zhì)和所處溶液組分及酸堿度等因素進(jìn)行全面分析 。綜合考慮上述4個方面，選擇的離子交換劑才能成功地分離樣品,三、操作 1

18、.離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型 取適量的固體離子交換劑先用水浸泡，待充分膨脹后加大量的水懸浮除去細(xì)顆粒，爾后改用酸堿浸泡，以便除去雜質(zhì)和使其帶上需要的反離子。疏水性離子交換劑可以用2-4倍的2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液處理；而親水性離子交換劑則只能用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl處理(室溫下處理30分鐘) 。酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。在每次用酸(或堿)處理后，均應(yīng)先用水洗滌至近中性，再用堿(或酸)處理。末了用水洗滌至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可使用或裝柱,使用過的離子交換劑，可采用一定的方法使其恢復(fù)

19、原來的性狀，這一過程叫做再生。再生可以通過上述的酸、堿反復(fù)處理完成，但有時也可以通過轉(zhuǎn)型處理完成。所謂轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)為另一種反離子的過程。比如，欲使陽離子交換劑轉(zhuǎn)成鈉型時，則需用NaOH處理；欲使其轉(zhuǎn)成氫型時，則需用HCl處理；欲使其帶銨離子時，則需用NH4OH或NH4Cl處理。 長期使用過的樹脂含有很多雜質(zhì)，欲將其除掉，應(yīng)先用沸水處理，然后用酸、堿處理。用熱的稀酸、稀堿處理效果更好。樹脂若含有脂溶性雜質(zhì)時，可用乙醇或丙酮處理。而長期使用過的親水性離子交換劑的處理一般只用酸、堿浸泡即可。原則上講，去除雜質(zhì)的過程應(yīng)在不破壞離子交換劑的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，不影響其原有交換容量的前提下進(jìn)

20、行,2.緩沖液的選擇 離子交換劑不僅可以與被分離物進(jìn)行交換，而且還可以與緩沖液中的離子進(jìn)行交換。因此，離子交換劑吸附被分離物的量與緩沖液的pH值和離子濃度有密切關(guān)系。 起始緩沖液pH值和離子強(qiáng)度要能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，而雜質(zhì)與交換劑不結(jié)合，則pH值一般比有效成分的pI高一個單位(用陰離子交換劑)或低一個單位(用陽離子交換劑)，離子強(qiáng)度為0.1時，就可很快地把有效成分與雜質(zhì)分開。或者選擇起始緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值，使有效成分與離子交換劑結(jié)合得不牢固，而雜質(zhì)與離子交換劑結(jié)合得牢固，也能得到高純度有效成分。選用的洗脫液，其離子強(qiáng)度和pH值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來，一般離子強(qiáng)

21、度要比起始緩沖液高，pH值要按離子交換劑性質(zhì)來選擇,3.被分離物質(zhì)的交換 使用離子交換劑的方法有兩種：一種是柱層析法，也叫動態(tài)法，即將離子交換劑裝入層析柱內(nèi)，讓溶液連續(xù)通過。該法交換效率高，應(yīng)用范圍廣；另一種是分批法，也叫靜態(tài)法，即將離子交換劑置入盛溶液的容器內(nèi)緩慢地攪拌。該法交換率低，不能連續(xù)進(jìn)行，但是，需要的設(shè)備簡單，操作容易。 柱層析法裝柱的操作和要求與吸附柱層析相同。離子交換劑的總用量要依據(jù)其交換容量和待吸附物質(zhì)的總量(包括連續(xù)使用的全部量)來計算。當(dāng)溶液含有各種雜質(zhì)時，必須考慮使交換量留有充分余地，實際交換量只能按理論交換量的25%-50%計算。在樣品純度極低，或有效成分與雜質(zhì)的性質(zhì)

22、相似時，則實際交換量應(yīng)控制得更低些。層析柱高與直徑比例一般要大于101，分離樣品的成分復(fù)雜時，比例宜高一些，用于樣品濃縮和脫鹽時，比例可低一些,4.被分離物質(zhì)的洗脫與收集 在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。 梯度溶液按組成來分，一般有二種：一種是增加離子強(qiáng)度的梯度溶液。是用一簡單的鹽(如NaCl或KCl)溶解于稀緩沖液制成的，習(xí)慣上不用弱酸或弱堿的鹽類；另一種是改變pH 值的梯度溶液。該溶液是用兩種不同pH值或不同緩沖容量的緩沖液制成的，所用緩沖液的種類、pH值以及緩沖容量要認(rèn)真選擇，否則將達(dá)不到預(yù)期目的。對于增加離子強(qiáng)度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強(qiáng)度絕大部分是增加的。而改變pH值的梯度溶液則不然，如果使用的是陽離子交換劑，pH值應(yīng)從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，pH值應(yīng)從高到低遞減，實際許可的p