基因工程的原理和技術

1、利用基因工程原理讓大腸桿菌生產人胰島素又需要哪些基本操作步驟呢？,第二節(jié) 基因工程的原理和技術,基因工程（將人胰島素基因轉入大腸桿菌）,胰島素基因,人體細胞,大腸桿菌,隨細菌的增殖，胰島素基因也同時復制,胰島素,獲取胰島素基因的表達產物胰島素,形成重組DNA分子,導入 受體細胞,目的基因 檢測與鑒定,獲取 目的基因,基因工程的基本操作步驟（技術）,1、篩選含有目的基因的受體細胞,2、目的基因的表達,問題：獲取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我們對目的基因的堿基序列完全未知，比如:如果我們對抗蟲基因的堿基序列完全不知道，怎樣從蘇云金芽孢桿菌體內獲取目的基因（抗蟲基因）？ 如何操作？,大片段D

2、NA,打成許多小片段,小片段DNA,目的基因,載入運載體,細菌,重組DNA分子,重組DNA分子,例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲蛋白的基因,如果運氣不好，在打成小片段時，有可能把抗蟲基因打斷,如何從基因文庫中獲取目的基因?,大片段DNA,打成許多小片段,小片段DNA,目的基因,載入運載體,細菌,重組DNA分子,重組DNA分子,基因組文庫,對基因組文庫的所有細菌進行逐一篩查 找出有抗蟲蛋白的菌落 該菌落所攜帶的基因片段就含有目的基因,例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲蛋白的基因,容易嗎？,構建基因組文庫，獲取目的基因,一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,生物材料,DNA,提取,

3、限制酶,DNA片段,形成重組DNA分子,導入,受體菌群體,構建,基因組文庫,1.從基因文庫中獲取,思考：從基因組文庫中獲取人的胰島素基因，導入大腸桿菌能否成功表達？為什么？,思考： 能否根據mRNA合成沒有內含子的胰島素基因？,單鏈RNA （mRNA),逆轉錄酶,雜交雙鏈,核酸酶H,單鏈DNA,DNA聚合酶,雙鏈DNA,逆（反）轉錄法合成目的基因：,cDNA文庫的構建,水解RNA,一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,形成重組DNA分子,導入,受體菌群體,構建,基因組文庫,mRNA,目的基因 (cDNA),形成重組DNA分子,導入,

4、受體菌群體,構建,cDNA 文庫,1.從基因文庫中獲取,思考：基因文庫如同國家圖書館，而cDNA文庫則像某單位的圖書館，二者除了大小不同之外，還有哪些區(qū)別？,小,大,無,有,無,有,部分基因,全部基因,思考： 如果想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，需要構建哪一種基因文庫？,問題：獲取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我們對目的基因的堿基序列完全未知，怎樣辦？如何操作？ 思考2：如果我們已知目的基因的堿基序列，可以怎樣操作？,一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,導入,受體菌群體,構建,基因組文庫,mRNA,反

5、轉錄,目的基因 (cDNA),導入,受體菌群體,構建,cDNA 文庫,目的基因的核苷酸序列是已知,化學合成法,目的基因,1.從基因文庫中獲取,2.化學合成法,提取,形成重組DNA分子,形成重組DNA分子,問題：獲取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我們對目的基因的堿基序列完全未知，怎樣辦？如何操作？ 思考2：如果我們已知目的基因的堿基序列，可以怎樣操作？ 思考3： 如果我們已知蛋白質的氨基酸序列，又可以怎樣操作？,思考：能否根據氨基酸的序列獲得人胰島素基因的堿基序列？,化學合成法,一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,形成重組DN

6、A分子,導入,受體菌群體,構建,基因組文庫,mRNA,反轉錄,目的基因 (cDNA),形成重組DNA分子,導入,受體菌群體,構建,cDNA 文庫,目的基因的核苷酸序列是已知,化學合成法,目的基因,1.從基因文庫中獲取,2.化學合成法,提取,或可推測的,問題：獲取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我們對目的基因的堿基序列完全未知，怎樣辦？如何操作？ 思考2：如果我們已知目的基因的堿基序列，可以怎樣操作？ 思考3： 如果我們已知蛋白質的氨基酸序列，又可以怎樣操作？ 思考4：如果我們知道目的基因兩端的部分堿基序列，還可以怎樣操作？,聚合酶鏈式反應（PCR技術）,變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA

7、復性（退火）：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合 延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈,1.變性 升溫至95,2.復性 降溫至60,引物與母鏈結合,3.延伸 升溫至72,DNA聚合酶,解旋,PCR技術與原理,Taq DNA聚合酶有耐高溫的特點,思考：PCR技術擴增目的基因，需要什么前提和條件？過程如何？原理是什么？,聚合酶鏈式反應(PCR技術)擴增,原理：,目的：,前提：,條件：,DNA復制,獲得大量的目的基因,有一段已知目的基因（兩端）的核苷酸序列,以便根據這一序列合成引物。,模板DNA（目的基因）,耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶),四種脫氧核苷酸,兩種DN

8、A引物,一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,形成重組DNA分子,導入,受體菌群體,構建,基因組文庫,mRNA,反轉錄,目的基因 (cDNA),形成重組DNA分子,導入,受體菌群體,構建,cDNA 文庫,目的基因的核苷酸序列是已知,化學合成法,3.利用PCR技術擴增,目的基因,1.從基因文庫中獲取,2.化學合成法,提取,獲取大量目的基因,或可推測的,最快第幾輪能得到目的基因？,DNA分子,目的基因,解旋酶,高溫（加熱至95）,RNA引物,DNA引物,解旋酶、DNA聚合酶等,TaqDNA聚合酶,人工基因合成法,DNA合成儀,PCR擴增

9、儀,一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,問題：怎樣將目的基因與質粒進行重組？,質粒,目的基因,限制酶,同一種限制酶切割,質粒,外源基因,重組DNA分子 （重組質粒）,DNA連接酶,問題2：形成的重組質粒導入受體細胞后，除了能夠穩(wěn)定存在外，并且可以遺傳給下一代。同時，使目的基因在受體細胞中表達和發(fā)揮作用，需要對重組質粒作怎樣的修飾？,據圖回答：一個表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有哪些基本元件？,(二)形成重組DNA分子（構建基因表達載體),基因表達載體的組成,啟動子,目的基因,終止子,復制起點,標記基因,一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,通常用同

10、一種限制酶切割目的基因和載體(質粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA連接酶將二者連接,形成重組DNA分子（基因表達載體）。,用BamH對胰島素基因和質粒切割，加入DNA連接酶，得到的都是重組質粒嗎？,雙酶切連接：,思考：如何 避免質粒和目的基因的自身環(huán)化？,1、避免載體和目的基因的自身環(huán)化、載體和目的基因間反向連接 2、提高重組DNA分子的重組率,(三)將目的基因導入受體細胞,(二)形成重組DNA分子（構建基因表達載體),一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,常用的受體細胞：,有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。,將細菌用CaCl2處理，使細胞處于感受態(tài)，

11、可促進細胞吸收DNA分子,如果是導入微生物（如細菌）,感受態(tài)：細胞處于容易吸收外源性DNA的狀態(tài)。 處于感受態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞.,CaCl2,0,重組載體,感受態(tài)細胞,42,如果是導入微生物（如細菌）,(三)目的基因導入受體細胞,1. 轉基因微生物,重組DNA分子 (基因表達載體),CaCl2處理,感受態(tài)細菌細胞 (工程菌),目的基因隨受體細胞的繁殖而復制,增大細胞壁通透性,(二)形成重組DNA分子（構建基因表達載體),一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,吸收DNA分子,重組 DNA進入細菌細胞,如果是導入動物細胞,顯微注射儀,受精卵,思考： 培育轉基因動物時，受體細胞

12、能否采用動物體細胞？試說明理由。一般可以采用動物的什么細胞？,用口徑為1m的DNA注射器，將大量的目的基因片段注入到受精卵的核內，然后把經過注射的受精卵移植到另一只雌性動物的子宮內，使受精卵發(fā)育為轉基因動物。,(三)目的基因導入受體細胞,1. 轉基因微生物,重組DNA分子 (基因表達載體),CaCl2處理,感受態(tài)細菌細胞 (工程菌),目的基因隨受體細胞的繁殖而復制,增大細胞壁透性,2. 轉基因動物,重組DNA分子,顯微注射,受精卵或早期胚胎細胞(整合到染色體DNA上),轉基因動 物,動物細胞培養(yǎng),胚胎移植,(二)形成重組DNA分子（構建基因表達載體),一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)

13、獲得目的基因,吸收DNA分子,重組 DNA進入細菌細胞,或病毒侵染,思考： 1、如果是導入植物細胞，最好以什么細胞為受體細胞？一般采用的運載體又是什么？ 2、比如：培育抗蟲棉，怎樣操作才能成功導入？,農桿菌轉化法,農桿菌的Ti質粒T-DNA：(可轉移的DNA） 可轉移（也可以將目的基因轉移）至受體細胞中，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。,農桿菌轉化法,3. 轉基因植物,重組DNA分子,農桿菌,植物體細胞(整合到細胞染色體DNA上),侵染,植物組織培養(yǎng),轉基因植物,農桿菌轉化法,利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒（有鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um）表面的表達載體DNA

14、打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。 這是單子葉植物中常用的一種基因轉化方法，但是成本太高。,基因槍,花粉管,卵細胞,花粉管通道法,受精后,花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。,3. 轉基因植物,重組DNA分子,農桿菌,植物體細胞(整合到細胞染色體DNA上),侵染,植物組織培養(yǎng),轉基因植物,基因槍或 花粉管通道法,農桿菌轉化法,(三)目的基因導入受體細胞,(二)形成重組DNA分子（構建基因表達載體),一.基因工程的基本操作步驟（技術）,(一)獲得目的基因,(四)目的基因的檢測與鑒定

15、,問題1：根據中心法則，目的基因怎樣表達？成功表達的標志是什么？,按照基因表達順序逐步檢測，逐步過關,如何檢測 ？,思考：通常為什么要選用含有兩個標記基因的運載體？,沒有質粒,含目的基因的質粒,正常質粒,沒有質粒,含目的基因的質粒,正常質粒,DNA分子雜交法檢測目的基因,DNA分子雜交法,制作方法：,化學合成或PCR法合成,特點：,1.被放射性同位素標記,2.目的基因片段,3.單鏈DNA,原理：,堿基互補配對，檢測未知DNA分子,用途：,目的基因檢測,DNA指紋,親緣關系測定, 基因診斷。,DNA分子探針法,檢測轉基因生物體內是否已含有目的基因,同理： 核酸分子雜交技術,按照基因表達順序逐步檢

16、測，逐步過關,思考：受體細胞攝入目的基因后就說明目的基因完成了表達嗎？,檢測目的基因是否已轉錄出了mRNA,檢測轉基因生物體內是否已含有目的基因,檢測目的基因是否已轉錄出了mRNA,檢測目的基因是否已翻譯出了蛋白質,利用抗原-抗體的特異性結合,按照基因表達順序逐步檢測，逐步過關,問題：如何運用抗原抗體特異性結合的原理檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質？,檢測目的基因是否已翻譯出了蛋白質,利用抗原-抗體的特異性結合,將目的基因表達出的蛋白質作為抗原,制備抗體,檢測個體是否具有目的基因所對應表現(xiàn)型,按照基因表達順序逐步檢測，逐步過關,問題： 除了上述分子檢測外，你能否在個體生物學水平上進行檢測？例如，

17、如何檢測轉基因抗蟲棉具有抗蟲特性？,轉基因 抗蟲植物,用棉花葉片飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。,(四)目的基因的檢測與鑒定,1.目的基因是否導入：,(1)標記基因檢測法。,(2)DNA分子雜交法(DNA探針檢測法),2.目的基因是否表達：,(3)是否出現(xiàn)目的基因所控制的性狀:,(2)是否翻譯合成了蛋白質：,抗原抗體雜交檢測法,核酸分子雜交法,（1）是否轉錄出了信使RNA：,觀察法,基因工程的基本操作程序,基因文庫,獲取目的基因,基因組文庫,cDNA文庫,化學合成法,PCR擴增法,運載體（細菌質粒）,

18、酶切、連接，構建,重組DNA（基因表達載體）,受體細胞,導入,篩選,動物受精卵,植物體細胞,細菌細胞,組織培養(yǎng),發(fā)酵工程,胚胎移植,表達產物,轉基因動物,轉基因植物,目的基因的表達與鑒定,總結：,二.基因工程的原理,1.整體原理：,人工的基因重組,2.各步驟原理：,（1）基因能轉移：,基因是獨立的遺傳單位,（2）不同生物的基因能拼接：,不同生物的DNA有著相同的雙螺旋結構和堿基互補配對原則，限制酶和連接酶的作用。,（3）同一基因在不同生物的細胞中合成相同的蛋白質：,復制、轉錄和翻譯過程相同，密碼子具有通用性,3.優(yōu)點：,定向改變生物的遺傳特性,例1 科學工作者分離得到了某真核生物的基因A，將其

19、解離成兩條具有互補關系的單鏈，其中的一條與基因A的信使RNA進行配對，雜交后可以觀察到如圖所示的結構對此結果的合理解釋是（） A1、3、5、7為DNA/RNA的雜交體，2、4、6為單鏈DNA部分 B1、3、5、7為DNA/RNA的雜交體，2、4、6為單鏈RNA部分 C1、3、5、7為雙鏈DNA部分，2、4、6為DNA/RNA的雜交體 D1、3、5、7為單鏈RNA部分，2、4、6為DNA/RNA的雜交體,A,例2.質粒是基因工程中最常用的運載體，質粒上有標記基因（如圖所示），通過標記基因可以推知外源基因（目的基因）是否轉移成功。外源基因插入的位置不同，細菌在培養(yǎng)基上的生長情況也不同。右圖表示外源

20、基因插入位置（插入點有a、b、c），請據下表細菌生長情況，推測三種重組細菌與外源基因插入點相對應的一組是,A是c、是a 、是 b B 是c和b、是b、是c C是c和b、是c、是b D 是a、是b、是c,A,b,c,a,例3.培育轉基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作為標記基因,只有含卡那霉素抗性基因的細胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長。下圖為獲得抗蟲棉的技術流程.,抗蟲基因,含kan質粒,重組質粒,土壤 農桿菌,含重組質粒土壤農桿菌,A 構建,C 誘導選擇,導入,轉基因 抗蟲植株,再生植株,愈傷組織,離體棉花葉片組織,侵染,B 培養(yǎng)選擇,分化,D 檢測,（1）A過程需要的酶有 _ 。,

21、（2）B過程及其結果體現(xiàn)了質粒作為運載體必須具備 的兩個條件是_ 。,（3）C過程的培養(yǎng)基除含有必要營養(yǎng)物質、瓊脂和激素外，還必須加入_。,限制性核酸內切酶和DNA連接酶,能夠自我復制、具有標記基因,卡那霉素,4.如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進行檢測，D過程應該用_作為探針。,5.科學家發(fā)現(xiàn)轉基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。 將轉基因植株與_雜交，其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為1：1。 若該轉基因植株自交，則其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為_。 若將該轉基因植株的花藥在卡那霉素培養(yǎng)基上作離體培養(yǎng)，則獲得的再生植株群體中抗卡那霉素型植株占_%。,標記的目的基因,非卡那霉素敏感型,3:1,100,例4.科學家將外源目的基因與大腸桿菌的質