PCR實驗室SOP文件

1、pcr實驗室作業(yè)指導書 文件編號：第2版編制： 審核： 批準： 生效日期：2012年 月 日目 錄序號主 題 內(nèi) 容 代 號頁 號1pcr實驗室的設置及管理2pcr實驗室工作制度3實驗室內(nèi)務管理及清潔制度4pcr實驗室人員的配置及管理5實驗人員的培訓程序6pcr實驗室清潔程序7樣品編號的標準操作程序8pcr基因擴增實驗室的要求9pcr廢棄物的處理程序10試劑準備區(qū)工作制度、標準操作、程序文件11標本制備區(qū)工作制度、標準操作、程序文件12擴增區(qū)工作制度、標準操作、程序文件13產(chǎn)物分析區(qū)工作制度、標準操作、程序文件14pcr標本的保存操作程序15pcr標本的采集、運送、接收程序16pcr生物安全防

2、護措施17pcr實驗室化學試劑配18pcr實驗室記錄管理制度19pcr應急處理程序20pcr試劑的質(zhì)檢標準操作程序21pcr消耗品進購質(zhì)檢貯存程序22pcr室內(nèi)質(zhì)量控制操作程序23pcr室間質(zhì)量控制操作程序24pcr溫度校準標準操作程序25伯樂ptc-200型核酸擴增儀操作規(guī)程26abi 7300型熒光定量擴增儀操作維護規(guī)程27dyy-6c電泳儀操作維護規(guī)程28bio-rad geldoc_xr凝膠成像儀使用說明書29恒溫水浴箱操作維護規(guī)程30旋渦振蕩器操作維護規(guī)程31普通離心機操作維護規(guī)程32高速離心機操作維護規(guī)程33低溫高速離心機操作維護規(guī)程34冰箱操作維護規(guī)程35超低溫冰箱操作維護規(guī)程3

3、6生物安全柜操作維護規(guī)程37超凈工作臺操作維護規(guī)程38移液器操作維護規(guī)程 修 訂 頁序號文件編號頁碼需更改的內(nèi)容更改內(nèi)容批準人批準日期1234567891011121314151617181920pcr實驗室的設置及管理1目的：建立實驗室的合理設置和科學管理，防止實驗污染，保證檢測結(jié)果的可靠性。2適用范圍：本程序適用于分子診斷室的設置、工作流程和日常管理等。3負責人： 4細則：41 分子診斷室為檢驗科下設的專業(yè)實驗室，從事基因擴增檢測及相關實驗工作。42 本實驗室采用普通rt-pcr擴增和實時熒光定量pcr兩種技術(shù)作為臨床基因診斷的主要手段，實驗室分為四個區(qū)：試劑準備區(qū)（第一區(qū)）、標本處理區(qū)（

4、第二區(qū)）、擴增區(qū)（第三區(qū)）及產(chǎn)物分析區(qū)（第四區(qū)）。每一工作區(qū)配備專用的設備、儀器、輔助設施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區(qū)分標識。各區(qū)標簽顏色：紅色（第一區(qū)）、白色或綠色（第二區(qū)）、藍色（第三區(qū)）；專用工作服：粉紅色（第一區(qū)）、白色（第二區(qū)）、藍色（第三區(qū)）。標本的接收則在檢驗科標本接收處進行。43 各工作區(qū)專用的儀器設備、辦公用品、工作服、實驗耗材和清潔用具等，不可混用。44 各工作區(qū)配置、功能和內(nèi)務管理見各相關sop文件。45 嚴格遵守從“試劑準備區(qū)標本處理區(qū)擴增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進入前一工作區(qū)。46 非本實驗室工作人員，未經(jīng)許可不得入內(nèi)；進修、實習

5、或其他科室人員因需要，進入實驗區(qū)域（試劑準備區(qū)、標本處理區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)） 需首先熟悉本程序的各項規(guī)定并嚴格遵守執(zhí)行，在本實驗室人員監(jiān)督指導下進行。47 實驗完畢后做好清潔消毒工作。5. 本文涉及以下圖表：1.實驗室設計平面圖pcr實驗室工作制度1目的 ：保持良好的工作環(huán)境，以確保檢測結(jié)果的可靠性，防止交叉污染，防止差錯、事故及糾紛的發(fā)生。2適用范圍：所有本實驗室人員。3負責人： 4細則：41 本實驗室用于基因擴增檢測及相關實驗工作，不得進行其它實驗操作。42各區(qū)的用品不得混用。43在各區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套和帽子，嚴格按照操作規(guī)程。44試劑準備區(qū)只能進行試劑的貯存及配制等

6、相關操作（見相關sop文件）。45標本處理區(qū)只能進行臨床標本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴增反應管和測定rna時cdna的合成（見相關sop文件）。46擴增區(qū)只能進行dna或cdna的擴增、實時熒光pcr擴增產(chǎn)物的分析（見相關sop文件）。47產(chǎn)物分析區(qū)只能進行rt-pcr擴增產(chǎn)物的分析（見相關sop文件）。4. 8進行實驗時嚴格執(zhí)行本實驗室的各項操作規(guī)程，及時做好各種操作記錄，力求準確、可靠。實驗完畢，做好清潔、整理及分析統(tǒng)計等工作。49室內(nèi)儀器由專人負責，未經(jīng)許可，不得隨意使用或挪用；愛護使用儀器，定期進行保養(yǎng)與維修。4. 10 愛護醫(yī)院財產(chǎn)，注意安全；離開實驗室前應關好門窗，檢查水、

7、電等。pcr實驗室內(nèi)務管理及清潔制度1目的：保證實驗室日常內(nèi)務管理及清潔工作順利進行。2適用范圍：實驗室相關人員及相關清潔工人。3負責人： 4細則：41內(nèi)務管理制度a. 非本室工作人員未經(jīng)允許不得進入實驗室。b. 各區(qū)的用品不得混用。c. 實驗人員要有強烈的時間觀念，按時上下班，不遲到、早退。d. 進入實驗室的工作人員必須遵守實驗室的單一流向的規(guī)定，禁止逆向走動。e. 所有儀器（如pcr擴增儀）須有專人負責，并有使用維護記錄；實驗人員必須熟悉儀器性能后方允許操作，并嚴格遵守操作規(guī)程。f. 所有試劑進購、配制、質(zhì)檢、使用均要有記錄，未經(jīng)允許不得隨意帶出本實驗室。g. 各區(qū)的各種清潔消毒均應有記錄

8、，工作衣消毒時注意各區(qū)應分開進行處理。h. 注意保持實驗室衛(wèi)生整潔，嚴禁在室內(nèi)抽煙、吃零食，非實驗操作人員應盡量少入。i. 每天了解儀器運轉(zhuǎn)情況及試劑使用情況，負責儀器的整潔，安全；下班前檢查門、窗、水、電，節(jié)假日指定人員負責檢查實驗室的儀器、設備，確保安全。4.2 內(nèi)務清潔制度a. 實驗室地面保持平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的物品阻礙。 b. 合理規(guī)劃實驗室內(nèi)物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲存處，常用的物品要容易尋找到。c. 抽屜、柜子、文件類物品要作好標記，以方便識別。d. 實驗結(jié)束后用75%酒精對臺面進行清潔，并經(jīng)紫外燈進行消毒。e. 每天實驗結(jié)束后，紫

9、外燈消毒60分鐘后，依次關閉各區(qū)紫外燈并記錄照射時間f. 搞衛(wèi)生時，依次清潔四個區(qū)的實驗臺面和地面，各區(qū)清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單一方向流程的原則來進行清潔。g. 處理好各區(qū)廢棄物，高壓消毒后集中處理。h. 每周將工作服交消毒洗滌，不同實驗區(qū)的工作服分開洗 pcr實驗室人員的配置及管理1目的：保證實驗室有足夠數(shù)量的合格的具備開展該類實驗能力的實驗人員。2適用范圍：適用于實驗室人員配置、管理、培訓及考核。3負責人： 4細則：41 人員要求a. 鑒于pcr技術(shù)要求的特殊性、復雜性，本實驗室工人員應為有經(jīng)驗的醫(yī)學檢驗專業(yè)人員。b. 實驗室工作人員應參加上級舉辦的pcr技術(shù)培訓，并取得合

10、格證。c. 對于新進入本室的人員，如尚未取得pcr技術(shù)培訓合格證，應在實驗室有培訓合格證的上級技術(shù)人員的指導下進行實驗工作，實驗報告由有資格人員出具，并應在最短的時間內(nèi)取得上崗培訓合格證。d. 實驗室工作人員上崗前必須學習并掌握pcr實驗室管理文件。42 人員配置a. 實驗室應根據(jù)工作需要配備足夠的工作人員，目前實驗室有主管技師2人、技師？人，？人都已獲得培訓合格證，視工作量的增加和業(yè)務發(fā)展需要，會適當增加工作人員。b. 由實驗室負責人負責全面管理、技術(shù)指導、解決與臨床溝通及技術(shù)疑難問題；其他各級技術(shù)人員履行相應的工作職責。43 人員管理實驗室建立所有工作人員的技術(shù)檔案，包括：學歷、任職資格、

11、發(fā)表論文、研究成果、培訓等相關材料復印件。技術(shù)檔案分文本檔案和電子檔案，文本檔案每年更新1次，電子檔案隨時更新。5. 本文涉及以下圖表：實驗室主要負責人簡歷表 pcr實驗室工作人員一覽表 人員檔案卡 實驗室人員的培訓程序1.目的: 保證實驗室有足夠的技術(shù)力量和科室適應長遠發(fā)展的需要。2.適用范圍: 核酸擴增熒光檢測實驗室實驗人員及預備培訓的人員。3.負責人: 4.細則：4. 1實驗室負責人或負責人指定人員參加每年省cdc的室間質(zhì)評總結(jié)會。4. 2實驗室工作人員每12年至少參加1次pcr技術(shù)的省級或國家級繼續(xù)教育項目，參加相關學術(shù)交流會議。4. 3安排未取得上崗培訓合格證的工作人員在合適的時間內(nèi)

12、參加技術(shù)培訓。4. 4科室不定期組織實驗室內(nèi)部實驗人員學習、更新核酸擴增方面的相關知識，提升自身的理論學習水平。特別是在標本接收區(qū)采血、接收標本的人員，需定期對其進行有關核酸擴增技術(shù)，標本采集、保存、運輸?shù)戎R的培訓。4. 5本實驗室工作人員每年進行考核一次,考核內(nèi)容:a)日常工作質(zhì)量b)室內(nèi)質(zhì)控測評c)室間質(zhì)控測評d)在抱怨處理中的表現(xiàn)4. 6本實驗室工作人員均建立業(yè)績檔案,實行能進能出制度,不斷吸收高質(zhì)量人員,加強培訓和提高, 對于不適合本室工作的人員要及時調(diào)離。5. 本文涉及以下表格 培訓申請表 年度培訓計劃表 培訓記錄表 員工培訓履歷表 pcr實驗室清潔程序1目的：保證實驗室環(huán)境的整潔

13、，防止污染。2適用范圍：適于實驗室工作環(huán)境、實驗臺面、工作服、移液器等的清潔消毒工作。3負責人： 操作人： 4細則：41 實驗室地面必須平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的物品阻礙。42 合理規(guī)劃實驗室內(nèi)物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲存處，常用的物品要容易尋找到。43 抽屜、柜子、文件類物品要作好標記，以方便識別。44 實驗結(jié)束后用75%酒精對臺面進行清潔，并用紫外燈進行消毒。45 每天對使用過的移液器用75%酒精進行擦拭。 46 實驗過程中如發(fā)生標本或試劑外濺，應立即用75%酒精滴上，濾紙蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用移動紫外燈消毒。 47 每天實驗前開啟各區(qū)

14、的通風系統(tǒng)，各區(qū)實驗結(jié)束后，分別打開傳遞窗紫外燈、天花板紫外燈消毒實驗室，每次開啟 3060分鐘。 48 待紫外燈消毒時間足夠后，依次關閉各區(qū)紫外燈并記錄。 49 依次清潔四個區(qū)的實驗臺面和地面，各區(qū)清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單一方向流程的原則來進行清潔。 410 處理好各區(qū)廢棄物，交醫(yī)院集中處理。 411 每周將工作服交院洗衣房洗滌消毒，不同實驗區(qū)的工作服隔開洗滌。5. 本文涉及以下表格實驗室清潔消毒記錄表 垃 圾 處 理 記 錄 表 pcr樣品編號的標準操作程序1目的：保證標本編號的唯一性，也是準確發(fā)放報告的基礎。2適用范圍：使用核酸擴增熒光檢測實驗室所開展的幾？種檢測項目：流

15、感病毒、手足口病毒、霍亂弧菌等。3負責人： 操作人： 4細則：41 按檢測類型分類標記根據(jù)檢測項目的不同，每種檢測項目對應標記一種唯一的代號。如流感病毒標記為 ？，手足口病毒標記為？。42 按標本接收順序編號在同種檢測類型的標本中，按標本檢測順序編號。如第一個檢測流感病毒的標本編為？001，第二個檢測流感病毒的標本編為？002，第三個檢測結(jié)核的驗單編為？003等。43 編號步驟a. 對接受的標本，根據(jù)編號的基本原則編號，每個樣本對應一個唯一的編號（如？）。b. 在樣品送檢單和對應的樣品管上作好相同的標記。c. 做好標本的接收記錄，每個樣本的記錄都應包括以下信息：接收時間、送檢單位、患者姓名、性

16、別、年齡、標本類別、標本狀態(tài)、送標本者、接收人、標本編號等。d. 處理好樣品、點樣后，將反應管放入擴增儀上開始擴增。e. 擴增得到結(jié)果后，先在登記表上填入結(jié)果，作好記錄，再一一把實驗結(jié)果填入相應報告單。f. 發(fā)放檢驗報告單。5. 本文涉及以下圖表：pcr標本接收記錄表 pcr結(jié)果登記表表pcr基因擴增實驗室的要求1目的：規(guī)定在各區(qū)內(nèi)所進行的工作及其操作。2適用范圍：所有在本區(qū)內(nèi)進行的工作。3負責人： 操作人： 4程序：實驗室分四？區(qū):試劑貯存、準備區(qū)；標本制備區(qū)；擴增區(qū)；產(chǎn)物分析區(qū)。進入各區(qū)嚴格按照單一方向進行，即試劑貯存、準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)。各區(qū)及其設備、物品必須有明確的標記，

17、嚴禁混用。進入pcr實驗室的工作人員（含衛(wèi)生員），都必須遵守實驗室的規(guī)則，尤其嚴格遵守進入pcr實驗室的唯一流向。不可進入pcr擴增后區(qū)打掃衛(wèi)生，再返回擴增前區(qū)工作。防止非本室工作人員串崗，進入本室。尤其不得為找人，而逆向誤入pcr實驗室?？倓t（1） pcr實驗室工作人員應具備醫(yī)學檢驗、微生物檢驗基本知識，并受過pcr實驗的基礎知識和技能培訓。（2） pcr實驗室分試劑準備，樣本準備，pcr擴增和產(chǎn)物分析四個室，各室的實驗物品（含加樣器，試管架，吸頭，記錄紙，筆等），不得混用，須貼上標簽予以區(qū)別。（3） 實驗室技術(shù)人員必須嚴格按照pcr實驗室操作程序進行，包括實驗室擦洗。臺面消毒，離心管，吸頭

18、的無菌滅活準備，儀器使用和廢棄物處理等。（4） 進入實驗室的工作人員必須更換各室不同的工作服（含帽和鞋），勤換洗工作服，以及遵守實驗室的唯一流向的規(guī)定，嚴禁反向流動。（5） 進入pcr實驗室后區(qū)的物品不許帶進pcr實驗室前區(qū)。每天實驗開始前，必須清潔地面和消毒實驗室前區(qū)。實驗結(jié)束應紫外線消毒實驗臺面。每天下班前處理好廢物，應關好水、電、煤氣和門窗。（6） 定期校準和維修pcr儀、酶標儀及離心機、水浴箱等儀器設備。（7） 實驗室內(nèi)不得飲食、吸煙。4.1標本接收區(qū)a. 實驗人員進入該區(qū)須穿本區(qū)白色工作服，接收標本須戴一次性手套。b. 記錄實驗室干、濕度，登記冰箱溫度。使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和

19、筆，每項記錄，書寫工整詳細。c. 對送檢的標本實行雙簽制度，并仔細檢查是否符合檢測要求，對有不符合要求的標本及時通知相關科室重新采樣，并作記錄，每份標本需給出唯一性編號。d. 本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封好，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將垃圾帶出實驗室。e. 每次實驗結(jié)束后，清潔實驗臺及地面打開紫外燈消毒30分鐘。記錄紫外燈使用情況。4.2試劑貯存、準備區(qū)a. 使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細。b. 準備好的試劑送入下一區(qū) ，還原實驗臺面，將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將本區(qū)垃圾帶出實驗室。c. 白色工作服留在本區(qū)。d. 本區(qū)維持相對

20、正壓狀態(tài)（開啟緩沖區(qū)的排氣扇）。實驗結(jié)束后，清潔實驗臺及地面打開紫外燈消毒30分鐘。4.3標本制備區(qū)a. 實驗人員進入該區(qū)須在緩沖區(qū)更換專用藍色工作服及拖鞋。實驗中須使用一次性帽子，戴手套，手套在實驗過程中疑有污染應立即更換。b. 將傳入本區(qū)的試劑放入冰箱冷凍室試劑存放專區(qū)暫存。記錄實驗室干、濕度，登記冰箱溫度。c. 將檢測完的標本密封保存在毒種間-70冰箱中，然后記錄標本的保存情況。d. 使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細。e. 按試劑盒說明書對標本進行處理，將處理好的標本在生物安全柜內(nèi)加樣，記錄標本的處理過程。f. 將加樣后的試劑傳送下一區(qū)，還原實驗臺面，關閉所有儀器

21、，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。g. 使用過的離心管、吸頭實驗結(jié)束后須高壓消毒后方丟入垃圾袋，所有樣品應按有生物傳染性危險品對待。h. 將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將垃圾帶出本區(qū)。i. 將藍色工作服留在本區(qū)。j. 本區(qū)應避免不必要的走動，同時維持相對正壓狀態(tài)，實驗結(jié)束后，清潔安全柜、實驗臺及地面，打開紫外燈消毒30分鐘。4.4擴增區(qū)a. 實驗人員進入該區(qū)須在緩沖區(qū)更換專用？色工作服及拖鞋。b. 記錄實驗室干、濕度，登記冰箱溫度。c. 使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細。d. 將傳入本區(qū)加樣后的試劑上機擴增。e. rt-pcr擴增完成后，將

22、樣品通過傳遞窗傳入下一區(qū)；實時熒光pcr擴增完成后，記錄檢測結(jié)果，及時發(fā)放報告單；記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。f. 將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，然后將垃圾帶出實驗室。g. 將粉色工作服留在本室再離開實驗室。4. 5產(chǎn)物分析區(qū)a. 將傳入本區(qū)加樣后的試劑上機擴增b. 擴增完成后，記錄檢測結(jié)果，及時發(fā)放報告單，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。c. 將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，然后將垃帶出實驗室。d. ？工作服留在本室再離開實驗室e. 嚴禁本區(qū)物品帶至其他區(qū)，實驗結(jié)束后清潔該區(qū)打開紫外燈照射，最好整夜消毒，記錄紫外燈使用情況。5.

23、本文涉及以下表格pcr實驗室環(huán)境溫濕度記錄表 冰箱溫度登記表 實驗室清潔消毒記錄表 垃 圾 處 理 記 錄 表 紫外消毒車消毒記錄表 pcr廢棄物的處理程序1目的：保證實驗室、實驗人員和外部環(huán)境的安全。2適用范圍：核酸擴增檢測實驗室常用化學試劑（naoh、edta、乙醇、生理鹽水等）、實驗室廢棄物的處理；3負責人： 操作人： 4細則：4.1科室職責應對本室工作人員講明本程序在預防交叉、實驗室污染及切斷傳播途徑中的重要性，并要求嚴格執(zhí)行。4.2實驗室所有垃圾，裝入專用污物袋內(nèi)，各區(qū)備有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾袋（黃色）。使用過的一次性消耗品(如試管、吸頭、離心管、等)在實驗結(jié)束后立即高

24、壓消毒，再放入黃色垃圾袋內(nèi)，使用過的手套、鞋套等直接放入黃色垃圾袋內(nèi)再集中處理。4.3 夾取標本的工具，如鉗、鑷、吸管等，用后均應消毒清潔，進行微生物檢驗時，應重新滅菌，金屬工具可燒灼滅菌或消毒液浸泡；玻璃制品高壓蒸汽滅菌。4.6 盛標本的容器，若為一次性使用的紙質(zhì)容器及其外面包被的廢紙，用高壓蒸汽滅菌后集中處理；對可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15分鐘或加入10%次氯酸鈉溶液浸泡24小時，消毒液每日更換，消毒后用洗滌劑及流水刷洗，瀝干，用壓力蒸汽滅菌后備用。4.7 廢棄標本及其容器裝入黃色垃圾袋內(nèi)，高壓蒸汽滅菌后，交污物處理中心集中處理。4.8日常生活垃圾如紙屑等按一般垃圾處理。5.

25、 本文涉及以下表格 pcr廢棄標本處理交接表 試劑準備區(qū)工作制度 標準操作、程序文件1目的：規(guī)范試劑準備區(qū)的配置、功能、內(nèi)務管理等。2適用范圍：pcr實驗室。3負責人： 操作人： 4細則：4.1 配置： 普通冰箱？一臺，超凈工作臺一臺，臺式離心機一臺，混勻器一臺，加樣器一套，可移動紫外燈？一臺，空調(diào)一臺，生物垃圾桶和生活垃圾桶各一個，辦公用品若干。4.2 功能： 儲存溶液的準備，反應體系的準備，分裝，成品試劑和化學試劑的貯存，75%乙醇，？病毒培養(yǎng)液等簡單試劑的配制。4.3 內(nèi)務管理：f. 著裝和標識：本區(qū)工作服以白色？、專用設備以綠色？為標識。g. 實驗人員進入該區(qū)須穿本區(qū)專用白色工作服。實

26、驗中須戴一次性手套、鞋套或本區(qū)專用拖鞋。h. 記錄溫濕度計讀數(shù)和冰箱的溫度計讀數(shù)。（本區(qū)每天在工作前利用本區(qū)的溫控設備使溫度控制在15-25之間）i. 根據(jù)當天的標本取出當天實驗須配制和使用的試劑，其余試劑要立即收好放回冰箱內(nèi)。試劑的配制須在超凈工作臺內(nèi)完成。 j. 每次實驗均應清點庫存試劑，每周檢查有無過期或?qū)⒔狡诘脑噭?，或作報廢處理或優(yōu)先使用，避免浪費，然后記錄試劑的詳細保存情況。k. 實驗中使用的離心管、吸頭等均為一次性用品，使用時應在消毒有效期內(nèi)。l. 試劑準備工作完成后，將使用過的離心管、吸頭置于盛有84消毒液的廢液缸中，還原實驗臺面。m. 將準備好的試劑放入傳遞窗中。其他區(qū)的用品

27、不得帶入本區(qū)。每次實驗記錄，書寫工整詳細，應使用本室專用的、帶本室標識的記錄本、紙和筆。n. 走出試劑準備室，在緩沖區(qū)脫下工作服，將手套及鞋套置于專用污物桶中。o. 工作完畢打開紫外燈消毒30分鐘。 5. 本文涉及以下表格試劑保存使用登記表耗材使用登記表實驗記錄本反應體系配置說明書 標本制備區(qū)工作制度 標準操作、程序文件1.目的：規(guī)范樣本處理區(qū)的配置、功能、內(nèi)務管理等。2.適用范圍：pcr實驗室。3負責人： 操作人： 4細則：4.1 配置：冰箱一臺，生物安全柜一臺，臺式高速冷凍離心機一臺，混勻器一臺，加樣器一套，可移動紫外燈？一臺，電熱恒溫水浴箱？一臺，空調(diào)一臺，其它耗品、辦公用品若干。4.2

28、 功能： 本區(qū)負責各種標本、質(zhì)控樣品的核酸提取純化，儲藏，樣本貯存。4.3 內(nèi)務管理：a. 著裝和標識：本區(qū)工作服、專用設備均以藍色？為標識。b. 驗人員進入該區(qū)須穿本區(qū)專用藍色工作服。實驗中須戴一次性手套（手套需常更換）、鞋套或本區(qū)專用拖鞋。c. 從傳遞窗中取出試劑放入冰箱試劑存放專區(qū)暫存。d. 記錄溫濕度計讀數(shù)和冰箱的溫度計讀數(shù)。（本區(qū)每天在工作前利用本區(qū)的溫控設備使溫度控制在15-25之間）e. 核對標本的編號、類型和標本數(shù)量。f. 按試劑盒要求進行標本的裂解和提取處理，在生物安全柜上進行加樣，加樣后低12000rpm離心數(shù)秒。g. 使用本室專用的經(jīng)過無菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。h.

29、 使用過的離心管、吸頭須置于盛有5%施康消毒液的廢液缸中。i. 使用帶有本室標識的記錄本、紙和筆。其他區(qū)的用品不得帶入本室。j. 患者標本應按有生物傳染性危險品對待。k. 標本處理完成后，關閉所有儀器，記錄運行狀態(tài)。l. 走出標本處理區(qū)，在緩沖區(qū)脫下專用工作服，將手套、鞋套置于專用污物桶中。m. 實驗完畢打開紫外燈消毒60分鐘。 4.4核酸提取操作規(guī)程本實驗室使用江蘇碩世的核酸提取試劑取200l樣品于1.5ml離心管中加入400l lysis buffer,振蕩混勻，室溫孵育10分鐘加入450l binding buffer (已加無水乙醇)，振蕩混勻?qū)?00l混合液移至一新吸附柱中，4120

30、00rpm，離心1分鐘；棄廢液，將吸附柱放入同一收集管中將剩余混合液移至吸附柱中，412000rpm，離心1分鐘；棄廢液，將吸附柱放入新收集管中加入400l wb1，412000rpm，離心30秒；棄廢液，將吸附柱放入同一收集管中加入600l wb2 (已加無水乙醇)，412000rpm，離心30秒；棄廢液，將吸附柱放入同一收集管中412000rpm，空柱離心3分鐘將吸附柱放入新離心管中，在吸附柱膜中央小心加入50l elution buffer,室溫靜置2-5分鐘412000rpm，離心1分鐘-20保存?zhèn)溆?.本文涉及以下表格試劑保存使用登記表核酸提取說明書 擴增區(qū)工作制度 標準操作、程序文

31、件1.目的：規(guī)范基因擴增、分析區(qū)的配置、功能、內(nèi)務管理等。2.適用范圍：pcr實驗室。3負責人： 操作人： 4細則：4.1 配置：美國伯樂ptc-200型核酸擴增儀一臺，abi7300熒光定量檢測儀一臺，電腦一臺、可移動紫外燈一臺?、空調(diào)一臺、其它耗品、辦公用品若干。4.2 功能：進行擴增反應并對產(chǎn)物進行分析。4.3 內(nèi)務管理：a. 著裝和標識：本區(qū)工作服、專用設備均以紅色為標識。b. 實驗人員進入該區(qū)須穿本區(qū)專用紅色工作服。實驗中須戴一次性手套（手套需常更換）、鞋套或本區(qū)專用拖鞋。c. 從傳遞窗中取出已加樣并離心好的反應管上機擴增。d. 按熒光擴增儀的標準操作文件對各種標本進行檢測。擴增結(jié)束

32、后對檢驗結(jié)果進行分析。e. 記錄溫濕度計讀數(shù)。（本區(qū)每天在工作前利用本區(qū)的溫控設備使溫度控制在15-25之間）f. 作好擴增儀的維護、實驗數(shù)據(jù)的記錄、質(zhì)控記錄。g. 關閉擴增儀，記錄運行狀態(tài)。h. 實驗結(jié)束后將已經(jīng)擴增的反應管放入塑料套袋中密閉后帶出，脫下手套、鞋套置于專用污物桶中，由衛(wèi)生員清除。i. 實驗完畢打開紫外燈消毒60分鐘4.4核酸擴增操作規(guī)程 本實驗室使用美國伯樂ptc-200型核酸擴增儀和abi7300熒光定量檢測儀，在此對其操作規(guī)范？進行描述a. 伯樂ptc-200型核酸擴增儀操作1 開機,打開電源開關，儀器進行自檢（約一分鐘結(jié)束）；2 運行，顯示主菜單，運行一個程序： 從主菜

33、單中選擇run，按proceed，顯示菜單（和自己創(chuàng)建的文件夾）？用select鍵選擇要運行的程序，按proceed；3 設置樣品管子類型及反應體積在“vessel type”項中選擇，要使用的（管子、微型板和玻片），按proceed； 在“volume”項中輸入樣品體積（微升）按proceed；4 在“use heated lid”中選擇程序運行過程中是否熱蓋，按proceed；程序開始運行。b. abi 7300型熒光定量檢測儀操作 打開計算機，打開擴增儀電源開關；雙擊桌面上“7300 system software”圖標，進入abi 7300程序界面（圖1）；圖1 點擊“new docu

34、ment”進入新建實驗界面（圖2）；圖2 點擊進入模版選擇界面（圖3）；圖3 選擇hbv后點擊按鈕，回到前一個界面；點擊按鈕，進入樣本設置界面（圖4）；圖4 在這個界面里，默認所有的孔位都有樣品。該圖標表示：第35號標本，該圖標表示：標準品4，濃度誒5104拷貝/毫升。根據(jù)當天標本的實際情況把沒有放置標本的孔位去除：首先拖動鼠標將沒有放置標本的孔位選中（按住ctrl鍵的同時用鼠標選擇相應孔位），點擊“hide/show well inspector”,進入選擇界面（圖5）。圖5 將選擇框中的“”去掉，變成，點擊回到圖4，同時被選中孔中的會被去掉。在圖5 中請確認中顯示的為“（none）”。 輸

35、入標準品的方法：請先選擇要設置為標準品的孔位點擊進入如下界面，將“task”下選項設置為“standard”,在“quantity”下輸入相應標準品的拷貝數(shù)，如“50000”(圖6)圖6 設置好標本及標準品后，點擊中的進入反應條件設置界面（圖7）。圖7 一切設定好后，點擊“save document”,在跳出的如下界面中輸入文件名（一般用項目名+年月日表示），如“hbv20060526”(圖8).然后點擊回到圖7。圖8 點擊進入實驗階段(圖中“start”因為沒有聯(lián)機呈灰色),此時機器會調(diào)用實驗所需的程序，稍后會出現(xiàn)實驗所需時間及實驗中的溫度變化情況。一般等這些數(shù)字顯示出來就可以放心離開了。

36、實驗過程中可以點擊圖7中進入實時熒光pcr界面。點擊中的可以進入實時熒光pcr擴增曲線的實時顯示界面。 實驗結(jié)束后分析實驗結(jié)果并保存數(shù)據(jù)，退出軟件的主菜單；關掉電腦，關閉abi-7300儀器正面的電源開關.c. abi 7300型熒光定量檢測儀實驗結(jié)果分析 a. 實驗結(jié)果無效的判斷標準：出現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當次實驗結(jié)果不可發(fā)，查找原因，重做實驗。1 陰性對照出現(xiàn)擴增。2 陽性對照無擴增。 3 大批甚至所有的標本都擴增了。4 室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果出現(xiàn)失控情況，實驗失控的具體標準詳見室內(nèi)質(zhì)控標準操作程序。 b. 實驗結(jié)果有效的判斷標準：達到下列要求后，當次實驗有效，可以發(fā)放結(jié)果。1 陰

37、性對照沒有擴增，陽性對照擴增。2 熒光擴增儀陽性標準品梯度曲線平滑均勻，斜率、截距和相關系數(shù)三個參數(shù)的數(shù)值均在范圍內(nèi)。3 室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果處于在控狀態(tài)。5. 本文涉及以下表格室間質(zhì)評記錄表 pcr室內(nèi)質(zhì)控記錄表 室內(nèi)質(zhì)控圖 產(chǎn)物分析區(qū)工作制度 標準操作、程序文件1、目的：保證擴增結(jié)果分析的標準化、規(guī)范化。2適用范圍：適用于本室使用的六一儀器的dyy 6c型瓊脂糖凝膠電泳儀和美國伯樂bio-rad gel doc xr 凝膠成像儀。3負責人： 操作人： 4細則：4.1 配置： 凝膠電泳儀一臺，凝膠成像儀一臺，電腦一臺、可移動紫外燈一臺?、高壓消毒鍋一臺？、空調(diào)一臺、其它耗品、辦公用品若干。4.2

38、 功能：進行擴增反應產(chǎn)物進行分析。4.3 內(nèi)務管理：a. 著裝和標識：本區(qū)工作服、專用設備均以？色為標識。b. 實驗人員進入該區(qū)須穿本區(qū)專用？色工作服。實驗中須戴一次性手套（手套需常更換）、鞋套或本區(qū)專用拖鞋。c. 從傳遞窗中取出已擴增好的反應管取樣電泳并分析結(jié)果。d. 記錄溫濕度計讀數(shù)（本區(qū)每天在工作前利用本區(qū)的溫控設備使溫度控制在15-25之間）；作好儀器的維護、實驗數(shù)據(jù)的記錄。e. 關閉儀器，記錄運行狀態(tài)。f. 實驗結(jié)束后將已經(jīng)擴增的反應管放入塑料套袋中密閉后帶出，脫下手套、鞋套置于專用污物桶中，由衛(wèi)生員（經(jīng)培訓）清除。g. 實驗完畢打開紫外燈消毒60分鐘4.4凝膠電泳儀及凝膠成像儀操作

39、規(guī)程a. 凝膠電泳儀操作 1 確認電源符合要求后，開啟電泳儀的“電源開關”；2 儀器蜂鳴4聲后顯示上一次工作的設定值；因是重復同一參數(shù)使用時，即可直接選擇start后啟動；3 按【啟/?！挎I后，儀器鳴響4聲，輸出啟動，“輸出指示燈”閃亮，開始工作（當輸出穩(wěn)定后，穩(wěn)壓/穩(wěn)流狀態(tài)改變時，儀器會自動鳴響2聲以示提醒用戶）；4 定時到后儀器自動顯示已用時間并反復鳴響，關機取出凝膠； b. 凝膠成像儀操作、5 將取出的凝膠置于適當?shù)妮d物平臺上6 關閉暗箱門7 調(diào)整濾光片8 打開相應光源9 接下來打開quantity one軟件，選擇file中選geldoc xr菜單,進入圖像采集界面10 按下live/

40、focus，成像儀進入實時成像11 選擇照明模式，一般熒光樣品選擇uv,普通透射或反射樣品選擇white模式 12 儀器面板上有三個上下鍵按鈕：iris（光圈），zoom（縮放），focus（聚焦），可在軟件上直接調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié)13 單擊auto expose,系統(tǒng)將自動選擇曝光時間成像（系統(tǒng)默認0.15%的像素飽和的成像時間為最佳時間，在options對話框中可以修改該項設置），如不滿意，單擊manual expose，并輸入曝光時間（秒） 14 圖像曝光滿意后，按下“freeze”按鈕15 按下“analyze”按鈕，將彈出一個新窗口顯示圖像，以供分析16 第5步結(jié)束后，也可以

41、按下“save”鍵，保存圖像5. 實驗結(jié)果分析 5.1 實驗結(jié)果無效的判斷標準：出現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當次實驗結(jié)果不可發(fā)，查找原因，重做實驗。1 陰性對照出現(xiàn)擴增。2 陽性對照無擴增。 3 大批甚至所有的標本都擴增了。4 室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果出現(xiàn)失控情況，實驗失控的具體標準詳見室內(nèi)質(zhì)控標準操作程序。 5.2實驗結(jié)果有效的判斷標準：達到下列要求后，當次實驗有效，可以發(fā)放結(jié)果。1 陰性對照沒有擴增，陽性對照擴增。2 室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果處于在控狀態(tài)。6. 本文涉及以下表格 標本的保存操作程序1目的：標本正確保存，以便必要時復查。2適用范圍：分子診斷室的所有檢測標本。3負責人： 操作人： 4程

42、序：41 處理前的標本保存 標本可4下短期（24h內(nèi)）保存，長期保存則需取出棉簽，保存于-70下。42 報告發(fā)出后的標本保存：a） 提取的核酸標本當天檢測可置4保存，如當天不檢測應置-70保存；報告發(fā)出后第二周丟棄。b）原始樣本在報告發(fā)出后放入低溫冰箱-70長期保存，以備復查或送檢。c）標本放置低溫冰箱保存時須有記錄，按編號順序存放，并由專人負責管理。43 特殊標本的處理：對暫不檢測的項目和規(guī)定時間外收到的零散樣本，要隨時登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤檢驗。標本一律置于-70下長期保存，使用時再按需取出檢測。5. 本文涉及以下圖表：pcr擴增接收標本記錄表 拒收標本記錄本 標本超低溫保存記錄

43、表 pcr標本的采集、運送、接收程序1目的：規(guī)范待檢標本的正確采集、送檢和處理。2適用范圍：分子診斷室的所有檢測標本。3負責人： 操作人： 4程序：41 標本的采集411 標本由接受過基因擴增檢測有關標本采集、保存、運輸知識培訓的人員采集并送至實驗室。412標本采集要求a. 咽拭子：讓患者用清水漱口，然后讓患者張口發(fā)“啊”音，必要時使用壓舌板；取出培養(yǎng)管中的拭子輕柔、迅速地擦拭兩腭弓、咽及扁桃體；將拭子插入試管中，塞緊瓶塞；b. 肛拭子：用棉花拭子在生理鹽水中浸濕，插入肛門2-3cm處，自肛門周圍皺襞處拭取，或在肛門口內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)涂擦，然后插入盛有生理鹽水的試管內(nèi)；c. 糞便：采集的糞便務求新鮮

44、，不可混入尿液；一般檢查留取少量（5g左右）糞便即可。盛糞便的容器要求干燥而清潔，不可有消毒劑和防腐劑，最好用一次性便盒。做細菌培養(yǎng)時，應采集于滅菌的糞便培養(yǎng)管內(nèi)送檢（采集標本時，應選擇帶膿血和粘液部分。如無膿血和粘液，可就糞便表面不同部分及糞端采取。如懷疑霍亂患者的糞便標本的采集。）；d. 皰疹液：用消毒針將皰疹挑破，然后用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封；以上操作均需使用無菌器材，并將拭子放入滅菌試管；注明標本留取時間，及時送檢。e. 腦脊液：腦脊液標本的采集量為1.02.0ml，采集后

45、，即裝入無菌帶墊圈的血清管中；42 標本的運送標本采集后，密閉、標（貼）姓名，應盡可能快的送至檢測實驗室，如運送時間需2小時以上，必須用冰盒送至實驗室。標本中如加入了適當?shù)姆€(wěn)定劑，如用于rna測定加入4mol/l異硫氰酸胍鹽（gitc）的血清（漿）標本和用于dna測定的edta抗凝血等，則可在室溫下運送或郵寄。45 接收451嚴格對各類樣本的查對和雙簽制度，對病房各樣本及時進行驗收，查對，不符合要求的樣本一律退回，并有書面記錄。452 分類驗證a. 一般內(nèi)容 進入實驗室的樣本在進行編號、離心前，工作人員應再次認真查對姓名，編號等。對不符合要求者應作記錄，并及時通知送檢單位，正確及時地補采樣，以

46、免延檢測結(jié)果報告。對書寫不清楚的申請單，要及時與送檢單位聯(lián)系(可電話)，明確受檢者姓名，性別，年齡，地址和發(fā)病時間等；并作相應記錄。b. 實驗室人員對標本進行查驗，出現(xiàn)下表中不合要求的情況時，應拒收標本，登記并告知相關科室。類別拒收原因1未正確使用采樣液保存的標本2采樣液不足（3ml） 或過量（5ml）3標本容器破裂，標本被污染4標本的病人姓名、年齡、性別等與送檢單不相符5rna檢測，采樣時間超過 2小時6其他可能嚴重影響檢驗結(jié)果的原因c. 拒收程序a）對拒收的不合格標本應在拒收標本記錄本上登記。b）填寫不合格標本處置單，并隨同申請單送返送檢科室。c）必要時電話告之相關科室醫(yī)生或護士。5. 本

47、文涉及以下圖表：pcr擴增接收標本記錄表 pcr擴增拒收標本記錄表 pcr生物安全防護措施1目的：預防工作人員在實驗過程中被感染或污染。2適用范圍：適用于本室所有工作人員。3負責人： 操作人： 4細則：41 實驗人員在實施生物防護措施時，應嚴格遵守各項相應的規(guī)章制度，建立起強烈的生物防護意識。42 每天更換廢液缸的？2%戊二醛溶液，并保證2%戊二醛溶液用量為廢液缸內(nèi)總液量的五分之一左右。配置消毒液時，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封性良好。43 實驗臺面日常清潔時使用75%的酒精擦拭。44 每區(qū)每次實驗后紫外燈照射3060分鐘，如有需要可延長照射時間。45

48、所有標本均應視作傳染源，因此在標本的采集、運輸過程中，標本容器應完好無泄漏。46 處理標本時應穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體液標本以及試劑，應立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生物，水龍頭、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細菌污染。消毒劑可用“84”消毒液。47 在實驗過程中，病人標本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內(nèi)應立即用清水洗。48 實驗過程中在使用針具等銳器時，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時，應立即脫下手套，盡量擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時進行預防補救措施。49 在實驗過程中病人標本（血液、體液）外漏

49、時，應立即用2%戊二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。410 實驗完畢離開時，應脫下所有該實驗區(qū)個人防護裝備。411 實驗完畢后應對實驗室進行紫外消毒。412 遇有意外事故應立即報告科室負責人，當事人應立即注射相關疫苗或進行預防性治療，并進行醫(yī)學觀察，嚴重者應報告上級領導？。5. 本文涉及以下表格紫外消毒車消毒記錄表 實驗室清潔消毒記錄表 pcr實驗室化學試劑配制程序1目的：保證實驗中用到的各種溶液符合實驗要求。2適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用溶液：4%naoh溶液、75%酒精、消毒劑（三氯異氰尿酸或 二氯異氰尿酸鈉）、2%戊二醛溶液等。？電泳液3負責人： 操作人： 4程序：44 化學試劑的配制：441 用具：干燥潔凈的250ml量桶一只，1000ml量桶一只，1000ml燒杯一只，三角燒瓶兩只，天平一架，100m