六月青含藥血清對(duì)HepG2215細(xì)胞系HBsAg與HBeAg表達(dá)的影響

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減六月青含藥血清對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞系HBsAg與HBeAg表達(dá)的影響（作者：?jiǎn)挝唬亨]編：）作者：林興黃權(quán)芳張士軍劉曦黃仁彬【摘要】目的觀察六月青（Liuyueqing，LYQ含藥血清的體外抗乙型肝炎病毒的作用。方法以 MTT法檢測(cè)藥物在體外對(duì)HepG2.2.15細(xì) 胞的生長(zhǎng)抑制作用，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測(cè)HepG2.2.15 細(xì)胞上清液中HBsAgHBeAg的滴度。結(jié)果LYQ含藥血清對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞50%生長(zhǎng)抑制率的給藥劑量為11.56 g （kg d）-1 ;而對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌 HBsAg 50%生長(zhǎng)抑制率的給藥

2、劑量為0.178g （kg d）-1，其治療指數(shù)（TI）為64.94 ;另外，LYQ含藥血清對(duì) HBeAg卬制作用不明顯。結(jié)論LYQ含藥血清在體外有顯著的抗 HBV的 作用，且毒性較低?！娟P(guān)鍵詞】 六月青含藥血清；HepG2.2.15細(xì)胞；HBsAg; HBeAgAbstract : ObjectiveTo observe the effect ofthe serumcontaining Liuyueq ing （LYQ） on the expressi on of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells. MethodsThe toxicity of the

3、serum containing LYQon HepG2.2.15 cells was detected by meansof MTT.The inhibitoryeffects of the serum containing LYQ on theexcreation of HBsAg and HBeAg in HePG 2.2.15 cells were evaluated with method of en zyme lin ked immuno sorbe nt assay (ELISA).ResultsThe dose which the serum containing LYQ co

4、uld inhibit 50% HepG2.2.15 cells was 11.56 g. (kg.d)-1. The dose which the serum containing LYQ could inhibit 50% HBsAg was 0.178g. (kg.d)-1, and its treatment index (TI) on HBsAg was 64.94. The inhibitory effect of the serum containing LYQ on HBeAg was not obvious. Con clusi on The serum containing

5、 LYQ can inhibitHBVsignificantlyin vitro , and it is a low toxic drug.Key words: Serumcontaining Liuyueqing ; HepG2.2.15 cell ;HBsAg HBeAg六月青(Liuyueqing , LYQ系爵床科(Acanthaceae)植物肖雞籠(頂花 馬蘭)Taraphochlamys affinis (Gr iff) Bremekhu (Strobila nthes affin is (Griff) Y .C.Ta ng)的干燥地上部分1。六月青是復(fù)方六月雪(CLYX主要成分之

6、一，本課題組前期研究表明， CLYX具有明顯地抗HBW2, 3和保護(hù)急性化學(xué)性肝損傷的作用4。 本研究以轉(zhuǎn)染有HBV DNA勺HepG2.2.15為模型，采用中藥血清藥理 學(xué)方法，觀察LYQ含藥血清對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞系HBsAg與HBeAg表 達(dá)的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為篩選出復(fù)方六月雪中抗HBV主 要活性部位提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料HBsAg （乙型肝炎表面抗原）和 HBeAg（乙型肝炎E抗原）酶聯(lián)免疫 檢測(cè)試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司）；HepG2215細(xì)胞株，購(gòu) 自北京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病毒研究所，本室自行傳代，定期用 G418（種篩選抗生素）篩選；六月青水提物，由廣西醫(yī)

7、科大學(xué)藥理 學(xué)教研室和廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自行提取。阿昔洛韋（AciclovirACV：湖南迪諾制藥有限公司醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20070518;RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)13200-035）；小牛血清（美 國(guó)Gibco公司，批號(hào) 16000-036）； G418（美國(guó) Sigma公司，批號(hào) 108321-42）。2方法2.1 LYQ含藥血清的制備3月齡Wistar大鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只?？瞻讓?duì) 照組：予等量的生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組： ACV1X 10-4g （kg d）-1 ;LYQ1 組：13.2 g （kg d）-1 ； LYQ2組：6.6 g （

8、kg d）-1 ； LYQ3 組：3.3 g （kg d）-1 ； LYQ4組：1.7 g （kg d）-1 ； LYQ5組：0.9 g （kg d）-1。各組動(dòng)物在同樣條件下飼養(yǎng)，每日早晚各1次空腹灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h ）后2 h,乙醚吸入麻醉，腹主動(dòng)脈抽血，低速離心分離血清，并將每組動(dòng) 物的血清混合。經(jīng)56C 30 min滅活處理，經(jīng)0.45卩m的微孔濾膜， 再經(jīng)0.22卩m微孔濾膜過(guò)濾除菌后，置-20 C冰箱保存?zhèn)溆谩?.2 LYQ含藥血清的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法）取HepG2.2.15細(xì)胞1瓶，用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至

9、2X 104 cell ml-1，加入96孔培養(yǎng)板中（每 孔100卩l(xiāng) ），置CO2孵箱（37C, 5%CO）中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼 壁且生長(zhǎng)良好，吸除全部培養(yǎng)液，加入上述含藥血清100卩l(xiāng)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)72 h,培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔加入MTT10 卩l(xiāng)，于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后小心吸棄上清液后，每孔加DMSO 100卩l(xiāng)，微量振蕩器振蕩5 min，使結(jié)晶紫完全溶解。自動(dòng)酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm,參考波長(zhǎng)630 nm）讀取各孔OD直，記錄結(jié)果。按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒濃度（TC5C）和最大無(wú)毒濃度（TC0。2.3 ELISA法定量檢測(cè)HBsAg和

10、HBeAg將2X 104 cell ml-1的細(xì)胞懸液加24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.5 ml，置CO2孵箱（37C 5%CO2中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，除去全部培養(yǎng)液，根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果，以1.7 g （kg d）-1給藥劑量組的含藥血清為第1個(gè)濃度，再用完全 培養(yǎng)液系列2倍稀釋成4個(gè)濃度的應(yīng)用液，即相當(dāng)于5個(gè)給藥劑量級(jí)別：1.7 , 0.85 , 0.425 , 0.213 , 0.107 g （kg d）-1 的含藥血清，每孔加入上述各級(jí)別的含藥血清應(yīng)用液 0.5 ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù) 孔。連續(xù)培養(yǎng)72 h后，分別吸出上清液置于1.5 ml滅菌Eppendof 管中，-20

11、C保存，統(tǒng)一待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)，結(jié)果以抑制率表示，藥物對(duì)抗原的抑制百分率（% = : 1-實(shí)驗(yàn)孔抗原OD值/對(duì)照孔抗原O值X 100% 并按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。2.4藥效評(píng)價(jià)一般用治療指數(shù)(TI)來(lái)評(píng)價(jià)藥物的臨床應(yīng)用前景。TI二TC50/IC50 , TI2為藥物有效低毒，12.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以士 s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS 11.5軟件，配對(duì)t檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)各含藥血清加于單層 HepG 2.2.15細(xì)胞上，連續(xù)培養(yǎng)72 h后， 觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，檢測(cè)有無(wú)病變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了給藥劑量為13.2 g (kg d

12、)-1組的含藥血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率大于 50%7卜，其余各組 的抑制率均小于50%以MTT法測(cè)定細(xì)胞的活力，按照Reed-Muench 法計(jì)算得出：TC0=1.65 g (kg d)-1 , TC50=11.56 g (kg d)-1 , 即當(dāng)LYQ給藥劑量w 1.65 g(kg -d)-1時(shí)，其含藥血清對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞沒(méi)有毒性。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 LYQ對(duì)HepG 2.2.15的生長(zhǎng)抑制作 用(略)3.2病毒抗原抑制試驗(yàn)HepG 2.2.15在24孔培養(yǎng)板上生長(zhǎng)至單層，加入不同稀釋倍數(shù) 的LYQ含藥血清，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組，培養(yǎng)72h,分別取上清液測(cè)定HBsAg和HBeA

13、g并與細(xì)胞對(duì)照組比較，計(jì)算抑制率、IC50以及TI實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥劑量相當(dāng)于 0.2131.7 g （kg d）-1 的LYQ含藥血清對(duì)HBsAg的抑制率均高于50%與細(xì)胞對(duì)照組比較均 有P0.05，其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，經(jīng)計(jì)算，對(duì) HBsAg半數(shù)有效 給藥劑量IC50=0.178 g （kg d）-1，治療指數(shù)TI = 64.94。而對(duì)于 HBeAg LYQ在所選劑量范圍內(nèi)對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑 制率均低于50%抑制作用不明顯。結(jié)果見(jiàn)表 2。表2 LYQ對(duì)抗原的 抑制作用（略）4討論復(fù)方六月雪（CLYX是通過(guò)長(zhǎng)時(shí)期的民間臨床觀察而擬定的 治療急慢性乙型肝炎和肝硬

14、化的驗(yàn)方，主要由廣西民間草藥六月青、 白花蛇舌草、梔子花根等組成，本課題組前期大量的實(shí)驗(yàn)研究表明， 該方可有效地抑制鴨乙型肝炎病毒 DNA和 HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA 的復(fù)制2, 5, 6;無(wú)毒濃度的CLYX在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中可有 效地抑制細(xì)胞HBVDNA勺復(fù)制及HBsA（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg （乙型肝炎E抗原）的分泌3, 7;此外，CLYX寸CCI4, AP, D-Gal 所致小鼠急性化學(xué)性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用，并由此推測(cè)其保肝作用可能與誘導(dǎo)肝藥酶有關(guān)4。中藥復(fù)方成分非常復(fù)雜，其組方配伍多數(shù)是以某一味藥為主 其余為輔，諸藥發(fā)揮協(xié)同治療作用。為了能更好

15、地保證CLYX療效穩(wěn)定性，本研究對(duì)該方中的六月青進(jìn)行了抗 HBV藥效學(xué)研究，旨在篩選出該方有效活性部位，進(jìn)而為下一步分離純化有效化學(xué)成分， 建立處 方質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以HepG2.2.15細(xì)胞株作為對(duì)象，首先觀察不同給藥 劑量的LYQ含藥血清對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用，以MTT法測(cè)定 細(xì)胞的活力，按照Reed-Muench法計(jì)算得出：TC0=1.65 g(kg d)-1 , TC50=11.56 g - (kg - d)-1，提示 LYQ給藥劑量w 1.65 g - (kg - d)-1 時(shí)，其含藥血清對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞沒(méi)有毒性。而對(duì)抗原抑制作用的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物作

16、用72 h后，給藥劑量相當(dāng)于0.2131.7 g - (kg - d)-1的LYQ含藥血清對(duì)HBsAg的抑制 率在均高于50%提示LYQ在體外具有顯著的抑制 HepG2.2.15細(xì)胞 分泌HBsAg的作用(與細(xì)胞對(duì)照組比較 P0.05),且對(duì)HBsAg的抑制 作用呈現(xiàn)劑量依賴性，經(jīng)計(jì)算，對(duì)HBsAg半數(shù)有效給藥劑量IC50=0.178 g - (kg -d)-1 ,治療指數(shù) TI = 64.94。另外，LYQ對(duì) HepG2.2. 15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制率在所選劑量范圍內(nèi)均低于 50%抑制 作用不明顯。本實(shí)驗(yàn)初步表明LYQ含藥血清體外有明顯的抗 HBV的作用, 且毒性較低，并據(jù)此認(rèn)為六月青應(yīng)是復(fù)方六月雪中主要活性部位之 一，值得進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】:1林興，黃權(quán)芳，李江，等廣西民間藥六月青的性狀與顯微鑒定J.中藥材，2005, 28( 7): 541.:2張士軍，林 軍，蔣偉哲.等.復(fù)方六月雪對(duì)鴨乙型肝炎病毒DNA的抑制作用J.中藥材，2007, 30 (2): 191.:3楊霞芳，張士軍，黃春喜.等.復(fù)方六月雪體外抗HBV的實(shí)驗(yàn)研究J.內(nèi)科，2007, 2 (3): 317.:4蘇潔寒，榮延平，蔣偉哲，等.復(fù)方六月雪對(duì)急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用J .廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，20