(2021年整理)PCR實(shí)驗(yàn)室操作流程

1、pcr實(shí)驗(yàn)室操作流程pcr實(shí)驗(yàn)室操作流程 編輯整理：尊敬的讀者朋友們：這里是精品文檔編輯中心，本文檔內(nèi)容是由我和我的同事精心編輯整理后發(fā)布的，發(fā)布之前我們對(duì)文中內(nèi)容進(jìn)行仔細(xì)校對(duì)，但是難免會(huì)有疏漏的地方，但是任然希望（pcr實(shí)驗(yàn)室操作流程）的內(nèi)容能夠給您的工作和學(xué)習(xí)帶來(lái)便利。同時(shí)也真誠(chéng)的希望收到您的建議和反饋，這將是我們進(jìn)步的源泉，前進(jìn)的動(dòng)力。本文可編輯可修改，如果覺(jué)得對(duì)您有幫助請(qǐng)收藏以便隨時(shí)查閱，最后祝您生活愉快 業(yè)績(jī)進(jìn)步，以下為pcr實(shí)驗(yàn)室操作流程的全部?jī)?nèi)容。乙型肝炎病毒(hbv dna pcr abi7300)檢側(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序一、informationfortest檢測(cè)信息項(xiàng)目名稱乙型肝炎

2、病毒核酸方法聚合酶鏈反應(yīng)方法依據(jù)衛(wèi)生部全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第三版（2006）第七篇第六章第一節(jié)二、analyticalprinctple檢測(cè)原理聚臺(tái)酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr可對(duì)特定核苷酸片段進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增,而實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù),是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，熒光物質(zhì)有兩種：熒光探針和熒光染料。我們目前是使用taqman熒光探針的檢測(cè)原理:pcr擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅

3、熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；pcr擴(kuò)增時(shí),taq酶的5一3外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條dna鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加（圖一）。這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。三、操作步驟(一)試劑配制1、進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)，開啟冰箱冷凍層取出hbvdna檢測(cè)試劑盒。查看外包裝盒(包括生產(chǎn)批號(hào)、有效期），無(wú)誤后拆開試劑盒,取出核酸提取液、反應(yīng)液及taq酶（核對(duì)核酸提取液、hbvpcr反應(yīng)液及taq酶管上批號(hào)與試劑外包裝盒批號(hào)是否一致）（圖1）

4、，不一致則不可使用,需更換新的試劑。室溫平衡20min，完全融化后2000rpm離心備用。2、核酸提取液的分裝（1)取0。5ml離心管架置于超凈工作臺(tái)內(nèi)(開機(jī)前用紫外線消毒30分鐘），用右手拿起鑷子逐個(gè)將離心管放入離心管架（注意應(yīng)夾住離心管外壁，不能碰到管內(nèi)壁），擺放順序?yàn)闄M列從左往右擺，豎列為從上往下隔行排，離心管個(gè)數(shù)為n(n=樣本數(shù)+對(duì)照品+質(zhì)控品）。完成后將鑷子放回原位（圖2）。(2）用移液器準(zhǔn)確吸取核酸提取液50ul分裝至0.5m1離心管中（左上角第一排開始，從左住右依次加入)。因核酸提取液內(nèi)含固體沉淀顆粒物，為使顆粒均勻分布，故每次取樣時(shí)都要用移液器反復(fù)吸打3-4次（圖3)。分裝完畢

5、后將移液器量程歸位。(3）加完一架后用右手拿鑷子將離心管拿起，左手大拇指和中指夾緊離心管下部，然后用食指將蓋子蓋上,順序?yàn)椋簭挠蚁陆堑谝粋€(gè)開始，從右住左依次蓋上（圖4），離心管蓋全部蓋完后,通過(guò)傳遞窗轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。3、hbvdna反應(yīng)液的配制每批需設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照（同時(shí)檢測(cè)低值陽(yáng)性質(zhì)控品，則無(wú)需再檢測(cè)臨界陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。所需每批需配制數(shù)n=樣本數(shù)+對(duì)照品+陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品+質(zhì)控品，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:試劑hbv pcr反應(yīng)液taq酶用量（ul)35。70.3（1）每盒hbv-dna試劑可檢測(cè)32人份，根據(jù)每日需檢測(cè)標(biāo)本份數(shù)計(jì)算出每批所需hbv pcr

6、反應(yīng)液和taq酶用量（例有111人份需要進(jìn)行檢測(cè)，則有3盒試劑可直接使用10ul移液器將taq酶加入hbv pcr反應(yīng)液中，另有111-3*32=15人份試劑需將hbv pcr反應(yīng)液和taq酶使用移液器按反應(yīng)體系比例吸取至1。5m1離心管中配制（圖5）。（2）取出離心后備用的hbv pcr反應(yīng)液和taq酶，按上述要求配制后用旋渦振蕩器振蕩混勻510sec，然后再用離心機(jī)2000rpm離心10sec備用（圖6）.（3）從操作臺(tái)面上拿取hbvdha試劑配制盒(可選用空余的200u1槍頭盒）至超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開配制盒并用記號(hào)筆在相應(yīng)的孔位右旁按順序編號(hào)(圖7）。編號(hào)規(guī)則為:樣本擴(kuò)增反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的孔位按

7、相應(yīng)的樣本流水號(hào)編寫、陽(yáng)性質(zhì)控品反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的孔位編“q（如有高值則標(biāo)為h，低值為l)，陰性對(duì)照品孔位編“-”，臨界陽(yáng)性對(duì)照對(duì)應(yīng)的孔位編“,空白對(duì)照對(duì)應(yīng)的孔位編“b”，1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的孔位編“s1”，2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的孔位編“s2”，依此類推.（4)編號(hào)完畢后,用右手拿起鑷子夾起反應(yīng)管（abi7300使用的是八聯(lián)一薄壁反應(yīng)管,鑷子應(yīng)夾住反應(yīng)管外壁，不可接觸到內(nèi)壁.按(圖8）所示方向依次將所有反應(yīng)管(反應(yīng)管數(shù)=n）隔列擺放到配置盒上。(5）從離心機(jī)中取出已混好taq酶的pcr反應(yīng)液，用移液器(量程調(diào)至36ul)，準(zhǔn)確吸取反應(yīng)液并按從上到下、從左至右的順序依次加至反應(yīng)管中，注意：吸頭應(yīng)深入到反應(yīng)管底部

8、，放液時(shí)應(yīng)緩慢，切勿形成氣泡（圖9）。全部加樣完畢后將配制盒通過(guò)傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū).（二）標(biāo)本處理1、標(biāo)本、質(zhì)控品及對(duì)照品的處理(1）從冰箱冷凍室取出hbv dna陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性對(duì)照品，室溫平衡20min待其完全融化。adiconp 00012016-01-12（2）核對(duì)標(biāo)本和原始申請(qǐng)單的條形碼和檢驗(yàn)項(xiàng)目，無(wú)誤后依次粘貼上相應(yīng)的流水號(hào),如2、從傳遞窗中取出試劑準(zhǔn)備區(qū)分裝好核酸提取液的離心管架，移至生物安全柜內(nèi)在管蓋上用記號(hào)筆寫上阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3、。.。,陽(yáng)性質(zhì)控管標(biāo)上“q”（如有高值則標(biāo)為h，低值為l），陰性對(duì)照管標(biāo)上“-”,臨界陽(yáng)性對(duì)照管標(biāo)上“，.離心管蓋上標(biāo)記的是1,就表示該管要

9、加入流水號(hào)為p0001的標(biāo)本（圖10）.注意：每個(gè)離心管的編號(hào)方向都應(yīng)朝向管口開啟的方向。（圖11）3、去除標(biāo)本管蓋：將標(biāo)本從前處理取至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),按排列順序依次去除樣本管上的橡膠塞.具體操作為:在生物安全柜中，左手拿起血清管并固定，右手拇指和中指涅緊橡膠塞,右手食指輕輕頂住橡膠塞頂部凹面,逆時(shí)針?lè)较蜉p輕旋下橡膠塞后廢棄于裝有消毒液的垃極桶（圖12)。（注意：手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清，如手套上有血清則需及時(shí)跟換新的手套；待所有樣本管蓋都去除完畢后，也需更換新的手套。）4、樣本及對(duì)照品的處理：a、左手拿起樣本，用量程為200u1調(diào)至50u1的移液器準(zhǔn)確吸取樣本（注:為保證樣本的均一性和

10、吸樣準(zhǔn)確，每次取樣時(shí)需用移液器將樣本吸打35次；吸樣時(shí)移液器套筒不可接觸到樣本管內(nèi)壁）（圖13）b。吸樣完畢后，將樣本管放至另一試管架中(切勿不可將樣本放回原試管架位）（圖14）.c.再用左手按前面所述樣本流水號(hào)和離心管編號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系拿起相應(yīng)的離心管，打開離心管蓋(注：?jiǎn)问植僮?，食指和中指固定離心管，拇指稍向后上方發(fā)力打開管蓋，手指切勿碰到離心管口和管蓋內(nèi)側(cè))（圖15)。d。管蓋完全打開后，用左手食指、拇指和中指固定離心管，將吸頭中的樣本全部打入離心管底部,輕輕吸打混勻35次。（圖16）e。加樣完畢后棄槍頭干盛有消毒液的垃極桶中(注:一個(gè)吸頭只能用于一個(gè)樣本的吸樣，禁止使用一個(gè)吸頭重復(fù)吸取不同

11、樣本）。同時(shí)蓋上離心管蓋并放回離心管架(放回的位置需另起一行,切不可放回原位），繼續(xù)處理下一個(gè)樣本。對(duì)照品和質(zhì)控品同病人樣本一樣處理。（圖17)f。待一架離心管全部加樣完成后用振蕩混勻器充分振蕩混勻10-15秒。g。左手將混勻后的離心管轉(zhuǎn)移至恒溫金屬浴上（注：離心管需對(duì)稱的放置在恒溫金屬浴相匹配的孔槽內(nèi))，用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí),100誤差不超過(guò)1干浴10min(誤差不超過(guò)30sec）。（圖18）干浴時(shí)用離心管架置于加熱的離心管上，防止離心管蓋因加熱爆開導(dǎo)致標(biāo)本間的污染（圖19）。h。十分鐘后前后不超過(guò)半分鐘），右手用攝子夾起橡皮墊從恒溫金屬浴中拿出離心管（圖20）。i。將上述離心管按順序?qū)ΨQ放入低溫高速離心機(jī)轉(zhuǎn)子孔內(nèi)，擺放離心管時(shí)要將離心管開口朝內(nèi)，蓋上轉(zhuǎn)子蓋及離心機(jī)蓋后，12，ooorpm離心10min(注：離心時(shí)需在轉(zhuǎn)子孔內(nèi)放置0。5m1離心管專用適配器（圖21）。j.待離心結(jié)束后，取出離心管并按編號(hào)順序依次擺放在離心管架上（參照（圖10）的排列方式)并4c冰箱保存?zhèn)溆?；若?dāng)夭不使用，則應(yīng)保存在一20c條件下，使用前置室溫平衡20min，再以12,ooorpm離心10min.5、待全部樣本加樣完畢更換手套，左手用鑷子夾起反應(yīng)管蓋的一側(cè)的延伸段(不要碰到管蓋)，然后用右手大拇指從左住右依次蓋緊管蓋(不要碰到其他未蓋的反應(yīng)管口）(如圖22）。6、將反應(yīng)管連同試劑配置盒通過(guò)