藥品微生物檢驗特點及過程控制

1、藥品微生物檢驗特點及過程控制,中國藥品生物制品檢定所,2,藥品微生物檢驗特點及過程控制,藥品因素 環(huán)境影響 培養(yǎng)觀察 抽樣檢查 破壞試驗,方法驗證,過程控制,中國藥品生物制品檢定所,3,無菌/微生物限度檢查理念,中國藥品生物制品檢定所,4,微生物檢查的過程控制,一、實驗設(shè)施（硬件物質(zhì)保障） 二、檢驗程序（軟件有效的結(jié)果） 三、結(jié)果判斷（調(diào)查可靠的結(jié)論）,中國藥品生物制品檢定所,5,一、實驗設(shè)施,實驗室系統(tǒng) 操作環(huán)境 關(guān)鍵設(shè)備 對照培養(yǎng)基,物 質(zhì) 保 障,中國藥品生物制品檢定所,6,（一）、實驗室系統(tǒng),潔凈實驗條件 有效性：整體10000級、局部100級。 安全性：保護樣品、人員和環(huán)境。 可操作

2、性：方便、快捷、順暢。 潔凈實驗條件的維護、驗證 陽性菌實驗室達到P2生物安全標準,中國藥品生物制品檢定所,7,實驗室改造示例：原布局圖 擬定布局圖 建議布局圖1 建議布局圖2實驗室系統(tǒng)中檢所微生物實驗室,中國藥品生物制品檢定所,8,（一）、實驗室系統(tǒng),實驗室系統(tǒng)的管理與維護： 1、屏障系統(tǒng)的有效性 壓差、風速、微粒、照度 （外包服務合同） 2、清潔、靜態(tài)與動態(tài)監(jiān)控、熏蒸 3、環(huán)境菌庫 酒精棉球分離微生物 新潔爾滅分離微生物,中國藥品生物制品檢定所,9,環(huán)境菌庫,潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）： 頭狀葡萄球菌（Staphylococcuscapitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcush

3、aemolyticus） 緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii） 藤黃微球菌（Micrococcusluteus）,中國藥品生物制品檢定所,10,（二）、操作環(huán)境,1、隔離器 2、生物安全柜 3、超凈工作臺,中國藥品生物制品檢定所,11,（二）、操作環(huán)境,中國藥品生物制品檢定所,12,搽拭,菌液稀釋、分液的誤差為：5.5% 表面搽拭操作的回收率大于 99%,中國藥品生物制品檢定所,13,（三）、關(guān)鍵設(shè)備,微生物檢查薄膜過濾儀 一次性薄膜過濾培養(yǎng)器 應急檢驗用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器,中國藥品生物制品檢定所,14,（四）、對照培養(yǎng)

4、基,培養(yǎng)基適用性（靈敏度）； 培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標準化）。,對照培養(yǎng)基,理化評價（可控性）,生物學評價（有效性）,回收率比較,MPN比較,生長曲線比較,生態(tài)評價,某些CRS原則,固態(tài)培養(yǎng)基,液態(tài)培養(yǎng)基,瓊脂加減法,中國藥品生物制品檢定所,15,二、檢驗程序,中國藥品生物制品檢定所,16,二、檢驗程序,接受任務 實驗方案 實驗準備 樣品核對 實驗操作 過程監(jiān)控 培養(yǎng)觀察,有效的結(jié)果,物 質(zhì) 保 障,中國藥品生物制品檢定所,17,實驗室管理規(guī)范（軟件）,中檢所抗生素室微生物實驗室質(zhì)量管理體系 編寫說明及批準頁 1 實驗室概況 1.1 實驗室簡介 1.2 實驗室通訊資料 1.3 實驗室認可項目/參數(shù)

5、表 1.4 實驗室平面圖及功能區(qū)域 1.5 儀器設(shè)備總覽 1.6 常備試劑耗材一覽表 1.7 實驗室發(fā)展目標 2 管理規(guī)范 2.1 安全管理 2.2 業(yè)務流程 2.3 人員管理（6個SOP） 2.4 樣品管理（3個SOP） 3 標準操作規(guī)程 3.1 檢驗工作SOP（13個） 3.2 儀器操作SOP（30個） 3.3 實驗記錄SOP（9個） 4 實驗室保障 4.1 實驗室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供應商確定原則 4.2 實驗室設(shè)施服務商 4.3 實驗設(shè)備供應商 4.4 實驗室消耗品供應商,中國藥品生物制品檢定所,18,（一）、實驗準備,實驗準備應堅持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準備有備無患，應隨時保證“來之能戰(zhàn)”

6、 。 尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實驗器材等。,中國藥品生物制品檢定所,19,實驗準備無菌室專用酒精棉球制備實驗準備場地清潔實驗準備臺面清潔,中國藥品生物制品檢定所,20,（二）、樣品核對,盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性； 仔細核對樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問題樣品），同時盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進行比較實驗、比較分析； 樣品外觀檢查、完整性檢查。,中國藥品生物制品檢定所,21,樣品外觀檢查欣弗樣品外觀檢查刺五加樣品外觀檢查雙黃連樣品完整性真空檢漏,中國藥品生物制品檢定所,22,（三）、實驗操作,不斷完善標準化操作規(guī)程（S

7、OP），嚴格避免實驗室污染。,藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié),藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié),中國藥品生物制品檢定所,23,實驗操作物料進場,消毒液搽拭物品外表面,潔凈傳遞（風淋、紫外照射）,雙層無菌包裝,核心區(qū),外圍,實驗操作人員進場,一更,二更,核心操作區(qū),實驗操作無菌操作技術(shù),中國藥品生物制品檢定所,24,（四）、實驗過程監(jiān)控,樣品監(jiān)控,手指監(jiān)控,沉降菌監(jiān)控,無菌檢驗框架示意圖,中國藥品生物制品檢定所,25,三、結(jié)果判斷,長菌與否 分離鑒定 溯源調(diào)查 結(jié)果報告,可靠的結(jié)論,有效的結(jié)果,物 質(zhì) 保 障,中國藥品生物制品檢定所,26,三、結(jié)果判斷,是不是微生物？

8、 是什么微生物？ 微生物來自哪里？ 幾點思考 參見：FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環(huán)境菌的相似性考 察藥學學報，2007，42（11）：11891194 判斷無菌檢查陽性結(jié)果有效性的實驗探討藥物分析雜志， 2008， 28（05）：6671,中國藥品生物制品檢定所,27,1、長菌與否？,渾不渾濁? 物理變化、化學變化還是生物變化？,一靠經(jīng)驗 二靠實驗 三靠嚴格程序控制避免干擾,中國藥品生物制品檢定所,28,是不是微生物？,（1）、液體培養(yǎng)基渾濁 物理變化？化學變化？生物學變化？ （2）、平板上的菌落 瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層 菌落or藥渣？,中國藥品生物制品檢定所,29

9、,菌落or藥渣？,經(jīng)60Co射線大劑量照射再檢驗 延長培養(yǎng)時間到7天 重新劃線培養(yǎng) 鏡檢,中國藥品生物制品檢定所,30,2、分離鑒定,（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)； （2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80保存； （3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物； （4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應進一步鑒定，并逐一保藏。,中國藥品生物制品檢定所,31,是什么微生物？,宏觀：生長形態(tài) 微觀：鏡檢 鑒定：生化鑒定（API、BD） 核酸鑒定（16sRNA、DNA） ,中國藥

10、品生物制品檢定所,32,3、溯源調(diào)查,樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株 檢驗過程監(jiān)控菌株 環(huán)境菌（近期、遠期） 現(xiàn)場調(diào)查收集菌株,鑒定與相似性分析相結(jié)合,傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合,不同方法的交叉驗證,中國藥品生物制品檢定所,33,微生物來自哪里？,相似性分析 同源性分析 脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）,中國藥品生物制品檢定所,34,Sample Preparation,Automated measurement after drying of the samples!,2. Suspending,1. Harvesting,3. Loading,FT-IR Spektrum of micr

11、oorganisms,圖 不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系,中國藥品生物制品檢定所,35,The Infrared Spectrum,FT-IR spectrum is a fingerprint of the cells,Biochemical Structure of Cells,中國藥品生物制品檢定所,36,中國藥品生物制品檢定所,37,溯源性分析例1欣弗事件,圖29 欣弗培養(yǎng)物,圖30 欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢,中國藥品生物制品檢定所,38,中國藥品生物制品檢定所,39,溯源性分析例1欣弗事件,頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcuscapitis ssp capitis）

12、 溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus） 緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis） 科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcuscohnii sspcohnii） 藤黃微球菌（Micrococcusluteus） 溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。,監(jiān)測到的環(huán)境菌株,中國藥品生物制品檢定所,40,溯源性分析例2,雙黃連注射液,利巴韋林注射液,FTIR相似性分析,DuPont RiboPrinter基因指紋分析,中國藥品生物制品檢定所,41,幾點思考,（1）、怎樣才算是同一株菌？ 需要深入認識微生物本身 微生物變異

13、與保守的相對性； 分析方法的可變性與微生物本身的可變性； 生物學先鋒琳恩馬古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果將一個特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。,中國藥品生物制品檢定所,42,幾點思考,（2）、什么是最適宜的技術(shù)？ 需要深入認識分析微生物的技術(shù)和手段 形態(tài)學分析與相似性分析（生化反應譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），在權(quán)衡方法本身的邊界和微生物變異性邊界的基礎(chǔ)上，似乎更適合對親緣關(guān)系下一個否定的結(jié)論，即排除法，在這個意義上是否可以引入化學分析的3概念、精密度概念？,中國藥品生物制品檢定所,43,4、幾點思考,（2）、什么是最適宜的技術(shù)？ 16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于區(qū)分；變異率太高（高到普通傳代、培養(yǎng)難以控制）則沒有意義。但一般來說16sRNA cDNA序列水平具有確定意義，困難在于確定足夠長。 溯源分析不僅僅是鑒定到種，而是到株，對菌株的穩(wěn)定性認識？與之相關(guān)的技術(shù)粗放性問題。,中國藥品生物制品檢定所,44,4、幾點思考,（3）、怎樣下結(jié)論？ 分析的根本目的是要下一個結(jié)論 以檢驗活動為中心、以檢驗過程為線索、以實 驗事實為