染色體顯帶原理與技術(shù)PPT課件(實(shí)用課件)

1、,染色體顯帶原理與技術(shù)PPT課件(實(shí)用課件),2,一、染色體制備基礎(chǔ)知識(shí),（一）細(xì)胞及細(xì)胞周期 （二）從DNA到染色體,3,（一）細(xì)胞周期及有絲分裂,細(xì)胞：生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，也是生命活動(dòng)的基本單位。圖略。 細(xì)胞周期：指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。,G1期，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間； S期，指DNA復(fù)制的時(shí)期； G2期，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時(shí)間； M期，細(xì)胞分裂開始到結(jié)束。 G0期：間期細(xì)胞，細(xì)胞周期之外的細(xì)胞。,4,有絲分裂,5,（二 ）從DNA到染色體,DNA,螺線管,超螺線管,染色單體,核小體,壓縮7倍,壓縮40倍,壓縮

2、6倍,壓縮5倍,共計(jì)壓縮8400倍,6,核小體 nucleosome：染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu),7,DNA分子的不同存在形式：染色質(zhì)和染色體,染色質(zhì)：間期細(xì)胞核中遺傳物質(zhì)的存在形式。 染色體：分裂中期遺傳物質(zhì)的存在形式。一條染色體是一個(gè)DNA分子。,8,染色質(zhì)：根據(jù)在分裂期和間期的染色不同，分為,常染色質(zhì)：在間期核中分布較稀疏，淺染色，是轉(zhuǎn)錄活躍的DNA部分，一般位于核中央。在分裂期，位于染色體臂，深染色。含大量功能基因。 異染色質(zhì)：是呈凝集狀態(tài)的DNA與組蛋白的復(fù)合物，由于螺旋化程度高，又稱為濃縮染色質(zhì)，一般位于核內(nèi)膜的邊緣形成一薄圈，即稱周圍染色質(zhì)。主要位于位于染色體的著絲粒、次縊痕、端粒等位置。

3、間期和分裂期都深染色?；緹o功能基因。,9,基本概念,在細(xì)胞周期的有絲分裂中期，染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，一般所描述的染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)都是中期染色體。 染色體組型：又稱核型Karyotype，是指將動(dòng)物、植物、真菌等的某一個(gè)體或某一分類群（亞種、種、屬等）的體細(xì)胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對(duì)恒定的特征排列起來的圖像。 核型模式圖Idiogram：是指將一個(gè)染色體組的全部染色體逐個(gè)按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。,10,二、染色體顯帶技術(shù),11,Q帶：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗帶（富含AT的明帶，富含GC的暗帶）； G帶：Giemsa染料染色后所呈現(xiàn)的染色體區(qū)帶；（AT區(qū)

4、是深色） R帶：是中期染色體經(jīng)堿性磷酸鹽處理，丫啶橙或Giemsa染色后所呈現(xiàn)的帶型，一般與G帶正好相反； C帶：顯示著絲粒結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)及其它染色體區(qū)段的異染色質(zhì)。 T帶：是染色體端粒部位經(jīng)丫啶橙染色后呈現(xiàn)的區(qū)帶； N帶：Ag-As染色，主要染核仁組織者區(qū)域的酸性蛋白。 1975年建立了染色體高分辨顯帶技術(shù)。,12,幾種顯帶的制作方法之間的關(guān)系,13,G顯帶實(shí)驗(yàn)原理基礎(chǔ)G顯帶：制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋帶，表明每條染色體的特征。,只有可以分裂的活細(xì)胞，才能制備染色體。實(shí)驗(yàn)材料：人外周血淋巴細(xì)胞，植物血凝素（PHA）刺激血中的淋

5、巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，使其恢復(fù)增殖能力。 使用秋水仙素或者秋水仙堿破壞紡錘絲的形成，將細(xì)胞阻留在有絲分裂中期。從而獲得大量的細(xì)胞中期分裂相供染色體分析。-采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至72小時(shí)細(xì)胞進(jìn)入增殖旺盛期，此時(shí)加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞。 細(xì)胞低滲技術(shù)使細(xì)胞中的染色體在玻片上鋪散得更好，易于計(jì)數(shù)和觀察。 甲醇/冰醋酸固定液快速殺死和固定細(xì)胞。,14,染色體檢查過程（G顯帶）,培養(yǎng)細(xì)胞； 秋水仙素處理；抑制中期分裂相 低滲；使細(xì)胞膨脹 固定；染色體形態(tài)固定 滴片；分散染色體。冰片法，熏蒸法。 顯帶和染色； 顯微鏡下分析。,15,實(shí)驗(yàn)步驟

6、 1. 采血及接種培養(yǎng) 1.1 采血：滅菌注射器抽取外周靜脈血35ml(綠帽肝素抗凝管） 1.2 接種 在超凈工作臺(tái)中，注射器滴加25滴全血（6號(hào)針頭）至外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清），水平搖動(dòng)混勻。置37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6872小時(shí)。 1.3 終止培養(yǎng)前3540min，加入秋水仙素，使終濃度達(dá)到0.5g/ml。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)。 秋水仙素主要作用在于能阻滯微管(紡錘絲)形成，或使已形成的微管 解聚，從而使染色體停留在中期。 秋水仙素濃度大，則處理時(shí)間短，如濃度小，則處理時(shí)間長。但若秋水仙素加入過量，或處理時(shí)間過長，分裂細(xì)胞

7、多，染色體凝集和收縮變小，或發(fā)生異常分裂現(xiàn)象，甚至染色體破碎，不宜用于觀察染色體的形態(tài)及計(jì)數(shù)；秋水仙素加入太少，或處理時(shí)間偏短，染色體形態(tài)偏長或無中期分裂相。,16,2制片 2.1收集細(xì)胞：將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中，2000 rpm離心5分鐘 2.2 低滲：棄上清液，加入37預(yù)溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)混勻后，置37恒溫水浴箱低滲處理2025分鐘。 2.3預(yù)固定：加入 1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1）或清質(zhì)劑300ul，用吸管小心吹打、混勻，2000rpm離心5分鐘。 2.5 固定： 第一次：棄上清液，加入3ml固定劑，吹打細(xì)胞團(tuán)制成

8、細(xì)胞懸液后，室溫下固定15分鐘， 2000rpm離心5分鐘。 第二次：棄上清液，重復(fù)固定一次。 第三次： 棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細(xì)胞制成懸液。 2.6 滴片： 吸取少量細(xì)胞懸液，滴23滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散，水蒸氣熏蒸，70 2小時(shí)烤片，待染色。,17,3.G顯帶 3.1 取2.5胰酶溶液0.5ml，加入50 ml生理鹽水染色缸中（終濃度0.025%），用 1N HCl或1N NaOH調(diào)節(jié)PH7.0左右，置 37OC預(yù)溫。 3.2 將烤好的玻片標(biāo)本放入胰酶溶液中處理60秒鐘左右（胰酶消化時(shí)間需不斷調(diào)試，摸索。不同時(shí)間配制，不同批號(hào)胰酶，以及隨著處理

9、標(biāo)本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時(shí)間都會(huì)變化） 3.3 取出染色體玻片標(biāo)本，置于37預(yù)溫的生理鹽水中，終止胰酶的作用。 3.4 將玻片標(biāo)本放入37預(yù)溫的1：10稀釋的Giemsa染液中，染色510分鐘。 3.5 自來水沖洗，自然晾干。,18,19,G顯帶常見問題及處理：,培養(yǎng)細(xì)胞: 細(xì)菌污染。霉菌污染。細(xì)胞收獲量小。玻片上細(xì)胞間期核稀疏。 秋水仙素：大量染色體太細(xì)長，纏成毛線團(tuán)樣。分裂相很多，但染色體短小，分叉。 幾乎沒有分裂相。 低滲：太分散。不分散。 固定：太發(fā)毛。背景不干凈。有大團(tuán)塊深染色物質(zhì)。 滴片；不分散。太分散。 顯帶和染色；沒有條帶。條帶模糊。一個(gè)分裂相內(nèi)，有的染色體有條帶，

10、有的沒有。有的胰蛋白酶消化太過，有的分裂相則不足。Giemsa染不上色。染色太深。染色太淺。,20,各種組織標(biāo)本的染色體制作,不同的標(biāo)本，不同的檢查目的，需要調(diào)整染色體的制作過程。處理原則：使盡可能多的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，旺盛生長，大量分裂，防止污染。,21,外周血：5%小牛血清RPMI-1640，+PHA。檢查體細(xì)胞核型。 骨髓：10 %小牛血清RPMI-1640，不含PHA。檢查腫瘤細(xì)胞核型。 羊水：標(biāo)本珍貴。專用羊水培養(yǎng)基，防止母體細(xì)胞污染。檢查胎兒細(xì)胞核型。 絨毛組織：同上。細(xì)胞為細(xì)胞團(tuán)（組織），防止細(xì)菌污染。清洗、剪碎后消化成單細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)。檢查胎兒核型。 臍帶血：血液細(xì)胞，性質(zhì)

11、同外周血。一定注意防止母體污染！檢查胎兒核型。 活檢組織：如實(shí)體瘤標(biāo)本。 細(xì)胞系：永生細(xì)胞。直接常規(guī)制作染色體標(biāo)本即可。,22,C顯帶,將染色體用堿或者去垢劑處理后，再用 Giemsa 染色，可以得到只顯示著絲粒區(qū)域的 帶紋，稱為 C帶。,23,實(shí)驗(yàn)原理,C顯帶技術(shù)由Arrighi和Hsu于1971年發(fā)明，是顯帶技術(shù)中最簡單的一種帶型。其方法的本身是起源于原位雜交。Arrighi和Hsu發(fā)現(xiàn)用堿處理載玻片上的染色體使DNA變性之后，再在SSC溶液中、65的條件下使其復(fù)性，在受控制的條件下經(jīng)Giemsa染色可顯示出在染色體的一定部位是深染的。70年代用原位雜交的方法證明深染的區(qū)域（C帶區(qū)）是結(jié)構(gòu)

12、異染色質(zhì)的區(qū)域，也就是一般而言的DNA高度重復(fù)序列的區(qū)域。然而，現(xiàn)在更為流行的看法認(rèn)為氫氧化鋇或其它堿性物質(zhì)的處理是優(yōu)先提取了非C帶區(qū)的DNA，SSC的處理有助于帶型的清晰。,24,實(shí)驗(yàn)用品,光學(xué)顯微鏡，恒溫水浴箱，培養(yǎng)皿，小鑷 子，未染色的染色體標(biāo)本片（片齡一周內(nèi)）， 5%氫氧化鋇水溶液，2SSC液，0.2mol/L HCl，PBS，吉姆薩染液。,25,實(shí)驗(yàn)方法,1、制片：常規(guī)外周血法制備的標(biāo)本。 2、HCl處理：取5-7天標(biāo)本齡的染色體標(biāo)本， 選擇染色體分散好的標(biāo)本在0.2mol/L HCl中室溫下處理10分鐘-1小時(shí)，然后用自來（蒸餾）水沖洗干凈。這一處理是使DNA脫嘌呤，但沒有DNA骨

13、架的斷裂。（此步也可省略） 3、氫氧化鋇處理：將標(biāo)本浸入60-65的5%（飽和）氫氧化鋇液中，10秒至幾分鐘（隨標(biāo)本齡而變動(dòng)，常規(guī)：1-4分鐘；1月齡片：8-16分鐘，最好設(shè)置梯度），堿性處理可能通過產(chǎn)生一個(gè)高水平的DNA變性，促進(jìn)DNA溶解。,26,4、 2SSC處理：在60-65的2SSC液中處理90分鐘時(shí)，用自來水沖洗干凈，2SSC溫育可使DNA骨架斷裂并使斷片溶解。 5、 染色：用蒸餾水配制5%Giemsa，染色5-10分鐘，用自來水沖洗干凈，室溫下風(fēng)干后即可鏡檢。 6、 鏡檢：用顯微鏡高倍鏡鏡下檢查顯帶標(biāo)本，如著絲粒區(qū)域或異染色質(zhì)部位（1,9,16號(hào)染色體次縊痕）及Y染色體長臂q12

14、深染，染色體其它部位染色淺，即為可取標(biāo)本。若觀察到染色體均呈白色，那么，可能是堿處理或2SSC溫育過度。,27,顯帶觀察,嚴(yán)格地講，C帶顯示的是緊鄰著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)。可見，在人體染色體C帶標(biāo)本中，深染的有：1、絕大多數(shù)染色體的著絲粒區(qū)；2、第1，9和16號(hào)染色體的次縊痕；3、Y染色體長臂的遠(yuǎn)側(cè)端。,28,巴黎會(huì)議（1971）對(duì)各條染色體的C帶描述如下: 1號(hào) 大，從著絲粒擴(kuò)展到q。 2號(hào) 小。 3-8號(hào) 中等 9號(hào) 大，從著絲粒擴(kuò)展到q。 10號(hào) 中等。 11號(hào) 中等，但比10號(hào)或12號(hào)大些。 12號(hào) 中等。 13號(hào) 中等，有時(shí)分為二節(jié)。 14號(hào)-15號(hào) 中等。 16號(hào)大，從著絲粒向q擴(kuò)展。

15、,29,17號(hào) 中等。 18號(hào) 中等，但比17號(hào)大些。 19-22號(hào) 中等。 X 中等 Y在著絲粒處有一條非常窄的帶；q的末端有一寬帶。1，9，16號(hào)的C帶和Yq上的寬闊的遠(yuǎn)側(cè)帶都有明顯的形態(tài)變異及異態(tài)性。,30,31,32,R顯帶,原理： 在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中加入堿基的類似物，然后用紫外線照射后再用 Giemsa 染料染色，可以得到和 G顯帶相反的帶紋，稱為 R帶。 即G顯帶的深帶變?yōu)闇\帶，淺帶染成深帶。當(dāng)G顯帶顯示的染色體兩臂末端為淺帶時(shí)，如果兩臂末端發(fā)生缺失等異常，一般難以發(fā)現(xiàn)和識(shí)別，而R帶正好能將此處顯示出易于識(shí)別的深帶。所以，R顯帶技術(shù)有利于檢測(cè)染色體的末端缺失、重排等。,33,光學(xué)顯

16、微鏡、恒溫水浴箱、紫外燈、培養(yǎng)皿、 常規(guī)制片材料、BrdU、秋水仙素、2SSC溶 液（0.3mol/L NaCl+0.03mol/L檸檬酸鈉）、 Gimesa染液等。,實(shí)驗(yàn)用品,34,實(shí)驗(yàn)方法,1.常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，終止前10小時(shí)在培養(yǎng)基中加BrdU（使其終濃度為12g/ml）。 2.繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后加秋水仙素20g/ml的3滴（7號(hào)針頭垂直豎滴，使終濃度為0.04-0.08g/ml）。 3.常規(guī)收獲、處理細(xì)胞，制片。 4.在60恒溫水浴箱中，置一培養(yǎng)皿于水面上（皿內(nèi)加1/3 2SSC溶液，將所制玻片浸泡在內(nèi)）。距玻片10cm處放置一20瓦紫外燈，照射玻片30-45分鐘。 5.待紫外處理時(shí)間結(jié)束后

17、，用自來水沖凈。 6.Gimesa染色5分鐘，自來水沖凈，室溫干燥后于鏡下觀察。,35,注意： 1. Brdu的濃度和作用時(shí)間是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 2.紫外燈照射距離玻片太遠(yuǎn)也不利于帶型的顯示。 3. 若為女性標(biāo)本，還可見淡染的遲復(fù)制X 。,36,顯帶觀察,各號(hào)染色體顯現(xiàn)的帶紋與G顯帶相反，在G帶染色體標(biāo)本出現(xiàn)的深帶用R顯帶法就是淺帶，同時(shí)在G顯帶染色體標(biāo)本出現(xiàn)的淺帶用R顯帶法就是深帶。與G顯帶的對(duì)比圖：,37,R顯帶總體圖,38,39,G11技術(shù),G11式顯帶是一種特異性顯示9號(hào)染色體 次縊痕的顯帶方法，一般用于9號(hào)染色體次縊痕 多態(tài)分析、家系調(diào)查，親子鑒定等研究以及9號(hào) 染色體倒位的細(xì)胞遺傳

18、學(xué)分析。,40,實(shí)驗(yàn)用品,光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、染色缸、自 制新鮮染色體玻片、吸管、計(jì)時(shí)器、pH試紙、 蒸餾水、0.1N氫氧化鈉、Gimesa染液等。,41,實(shí)驗(yàn)方法,3 ml Gimesa原液中加入蒸餾水47 ml，混勻，用氫氧化鈉調(diào)pH至11。 將染色體玻片放入其中染色5分鐘左右。 自來水沖洗，干燥。 觀察可見9號(hào)染色體次縊痕染成紫紅色，其它染色體長短臂均顯示藍(lán)色。,42,注意事項(xiàng)： 1、染色體玻片片齡一般不要超過一周，且在顯 帶之前最好再次75烤片5分鐘。 2、pH值為11是顯帶成功的關(guān)鍵。 3、染色時(shí)間可先摸索，如整個(gè)背景為藍(lán)色、次 縊痕未出現(xiàn)，可相應(yīng)地延長染色時(shí)間；如整 個(gè)背景為紫

19、紅色、次縊痕不明顯則可相應(yīng)地縮短染色時(shí)間。,43,顯帶觀察：9號(hào)長臂次縊痕顯紫色,44,Q顯帶,70 年代初期，瑞典的化學(xué)家 Caspersson 首先用熒光染料喹丫因氮芥 ( Quinacrine Mustard) 處理染色體標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在熒光顯微鏡下每條染色體出現(xiàn)了寬窄 和亮度不同的輝紋，即熒光帶，而各條染色體有其獨(dú)特的帶，由此可以清楚地鑒別人類的每一條染色體，稱為 Q帶。,45,實(shí)驗(yàn)原理,染色體用一種易結(jié)合于富含AT的DNA的熒光染料染色， 如quinacrine，DAPI或Hoechst33258，通過UV熒光顯微鏡可以觀察染色體顯示亮度不同的帶紋，Q顯帶的帶紋與G顯帶的非常相似，亮帶相

20、當(dāng)于G顯帶的深帶，暗帶相當(dāng)于G顯帶的淺帶。,46,實(shí)驗(yàn)用品,光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、立式染色缸、 人外周血淋巴細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本（75中烤片3小 時(shí)，未經(jīng)染色）。pH6.0緩沖液，Soresens緩沖液 (pH6.0)、pH6.0的磷酸緩沖液。,47,實(shí)驗(yàn)方法,將標(biāo)本置于pH6.0緩沖液中浸510分鐘 后，再轉(zhuǎn)浸入用Soresens緩沖液(pH6.0)配制 的0.2%的喹吖因、阿的平染液中染色510 分鐘，用pH6.0的磷酸緩沖液漂洗2次，每次 5分鐘，于玻片上滴加12滴新鮮緩沖液，加蓋片，在熒光顯微鏡下觀察。,48,Caspersson等（1971）的方法：,取用空氣干燥標(biāo)本的玻片浸入95%

21、、70%、50%的乙醇和蒸餾水使其吸水浸入pH7的檸檬酸/磷酸鹽緩沖液中用預(yù)溫至20芥子喹吖因（50ug/ml）染液染色20分鐘 在上述緩沖液中漂洗三次，每次5分種然后用緩沖液蓋片封存在熒光顯微鏡下觀察。,49,顯帶觀察,帶型與G顯帶標(biāo)本一致，熒光顯微鏡下觀察染色體上呈現(xiàn)出的亮帶就相當(dāng)于G顯帶染色體標(biāo)本的深帶。 1號(hào)染色體： 短臂由遠(yuǎn)端的弱熒光節(jié)段逐漸過渡到一中等熒光節(jié)端，后者可分為兩條帶。長臂有5條中等熒光帶，中央一條最明顯，次縊痕的熒光陰性。,50,51,顯帶,此技術(shù)可以使13、14、15、21和22號(hào) 染色體的隨體和隨體柄著色。,52,實(shí)驗(yàn)原理,人類的近端著絲粒染色體(即13、14、 1

22、5、21和22號(hào)染色體)的副縊痕處與核仁形成有關(guān)，故稱核仁形成區(qū)（nucleolus-organizing region，NOR），它是中期染色體上的明顯結(jié)構(gòu)之一。應(yīng)用DNA-RNA分子雜交技術(shù),證明人類的18S和28S核糖體RNA (rRNA編碼結(jié)構(gòu))的基因(rDNA)位于NOR。目前已有多種技術(shù)可以顯示中期染色體上的核仁形成區(qū)。,53,其中最簡單而又準(zhǔn)確的方法是銀染法,即利用硝酸銀將具有轉(zhuǎn)錄活性的核仁形成區(qū)(rRNA基因)特異性地染成黑色,人們將這種銀染陽性的核仁形成區(qū)稱為Ag-NOR,它們是具有轉(zhuǎn)錄 活性的18SrRNA基因和28SrRNA基因所在的部位。 由于具有轉(zhuǎn)錄活性的rRNA基因

23、(rDNA)往往伴有豐富的酸性蛋白質(zhì),該類蛋白質(zhì)含有巰基（-SH）和二硫鍵（-S-S-）,能使AgNO3中的Ag+還原成Ag顆粒,因此有轉(zhuǎn)錄活性的核仁形成區(qū)常被鍍上銀顆粒而呈現(xiàn)黑色,沒有轉(zhuǎn)錄活性的NOR則不著色。故其著色程度與細(xì)胞中rRNA基因的轉(zhuǎn)錄活性相一致。在同一物種，Ag-NOR的數(shù)目以及它們?cè)谌旧w上的位置是相對(duì)恒定的，如果發(fā)生了改變就意味著rRNA基因的活性發(fā)生了變化，故此項(xiàng)技術(shù)是目前探討rRNA基因功能的方法之一,54,此外，人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合，這種聯(lián)合可能是造成近端著絲粒染色體不分離、斷裂和易位的原因。利用銀染技術(shù)可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看 到有銀染物質(zhì)相

24、連。因此，銀染近端著絲染色體聯(lián)合（Ag-stained acrocentric association ,Ag-AA）可以作為準(zhǔn)確地判斷人體細(xì)胞是否存在近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合的客觀標(biāo)準(zhǔn)。 目前，也將Ag-AA看作反映rRNA基因活性大小的一個(gè)指標(biāo)。所以銀染技術(shù)已逐漸受到重視，并已開始廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)、體細(xì)胞遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)、臨床細(xì)胞遺傳學(xué)及藥物、化學(xué)因素等的遺傳效應(yīng)的研究上。,55,實(shí)驗(yàn)用品,光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、移液槍、培養(yǎng)皿（ 干燥）、吸管、擦鏡紙、小鑷子、未染色的染 色體標(biāo)本片（片齡一周以內(nèi)）、硝酸銀、甲 酸、Giemsa染液、一次性離心管（15ml）、 去離子水、錫箔紙等

25、。,56,實(shí)驗(yàn)方法,1、設(shè)一60水浴箱；另置Giemsa染液缸于37水浴箱。 2、臨時(shí)配制新鮮的AgNO3溶液：取一次性離心管（15ml）一支，稱取AgNO3 5g溶于10ml去離子水中，加10ul甲酸，混勻。將一干燥培養(yǎng)皿漂于60水浴箱水面上。 3、將玻片用4層干凈擦鏡紙（略小于玻片大?。┥w好。 4、用吸管將AgNO3溶液慢慢滴于玻片紙上，直至擦鏡紙呈棕黃色（黑色）為止，一般5ml能滴兩張玻片。 5、擦鏡紙變黑后，用鑷子輕輕啟開擦鏡紙，（將玻片）用自來水沖干凈。,57,6、Giemsa染色：吉姆薩母液用蒸餾水按一定的比例稀釋。例如，10份蒸餾水加1份吉姆薩母液稀釋即為10：1。一般染色5分鐘

26、。 7、染色后的玻片標(biāo)本用自來水洗去多余染料，染色過深可用磷酸緩沖液脫色。室溫下風(fēng)干后即可鏡檢，必要時(shí)可用樹膠封片。鏡檢時(shí)先在低倍鏡下選擇分散好、長度適中的分裂相，然后轉(zhuǎn)換油鏡觀察其顯帶的情況，選擇顯帶好的標(biāo)本進(jìn)行核型分析。,58,注意事項(xiàng)： 1、AgNO3工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并注意避光。用錫箔紙包住離心管，放置時(shí)間不能超過20分鐘，如放置的時(shí)間較長，溶液出現(xiàn)混濁即不宜再使用。 2、 滴AgNO3液時(shí)，不能讓玻片干燥。注意防止銀染液濺至衣物和手上，以免留下難以去 除的黑色污點(diǎn)。 3、滴片時(shí)染色體標(biāo)本片一定要平置，以使染液均勻分布在標(biāo)本上，使標(biāo)本著色均勻。 4、一定要讓玻片擦鏡紙變黑后再?zèng)_洗。 5

27、、染色時(shí)間因材料而異，因吉姆薩染料批號(hào)不同、質(zhì)量上有差異，因此其染色液濃度和染色時(shí)間需作適當(dāng)調(diào)整。,59,顯帶觀察,13、14、15、21和22號(hào)染色體的隨體和隨體柄為黑色。,60,61,62,T顯帶,T顯帶是R顯帶的亞類，因?yàn)樘禺惖刂?在端粒而稱為T顯帶。T帶是R帶的最深染部 分，必須用特殊的高熱處理染色體，然后用吉 姆薩或與熒光聯(lián)合染色。但使用得不多，所以 在此只是作簡單介紹。,63,實(shí)驗(yàn)原理,端粒是維持染色體正常復(fù)制和上下代傳遞的三個(gè)基本功能單位之一。它的功能包括確保染色體末端的正常復(fù)制；防止斷裂的DNA與染色體末端的重組。它們亦是哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞減數(shù)分裂第一次分裂時(shí)同源染色體配對(duì) 的

28、起始部位。每次細(xì)胞分裂，染色體丟失其末端的約100核苷酸，此變短的端粒可為細(xì)胞提供一有絲分裂的時(shí)鐘。丟失的端粒序列可經(jīng)端粒酶的作用逐個(gè)加回。T顯帶技術(shù)專門顯示染色體端粒，可用于分析染色體端粒有無缺失、易位等畸變。T顯帶是R顯帶的亞類，因?yàn)樘貏e地著色在端粒而稱為T顯帶。T帶是R帶的最深染部分，必須用特殊的高熱處理染色體，然后用吉姆薩或 與熒光聯(lián)合染色。,64,實(shí)驗(yàn)用品,光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、培養(yǎng)皿、1ml 注射器、擦鏡紙、小鑷子、未染色的染色體 標(biāo)本片（片齡一周以內(nèi)）、磷酸鹽緩沖液 （pH6.7）、吉姆薩染液（pH5.1）、吖啶橙 染料。,65,實(shí)驗(yàn)方法,制片：常規(guī)外周血法制備的標(biāo)本。 把染色

29、體玻片標(biāo)本放在含吉姆薩的pH6.7磷酸鹽緩沖液中，加熱至87。 染色：用吖啶橙染料染色，或者經(jīng)同樣熱變性后用吉姆薩染液染色5分鐘。 鏡檢：用顯微鏡高倍目鏡下檢查顯帶標(biāo)本，如染色體末端出現(xiàn)一定的帶型，稱端帶型（T帶），即為可取標(biāo)本。,66,顯帶觀察,1、4、11和19號(hào)染色體短臂的末端顯出綠色T帶，以8、9、10和17號(hào)染色體長臂的端帶最為鮮明，5、12、14、16、20、21和22號(hào)染色體末端也稍顯綠色，3、6、18、X和Y染色體不顯端帶。熱處理如持續(xù)1525分鐘。11號(hào)染色體長臂近側(cè)段和19號(hào)染色體短臂近側(cè)段，以及22號(hào)染色體長臂近側(cè)段均顯示典型的中間綠帶。此法特別用于識(shí)別22號(hào)染色體的長臂

30、。熱處理30分鐘或更長時(shí)間，就會(huì)出現(xiàn)R帶型。,67,性染色質(zhì)檢測(cè)技術(shù),X小體檢測(cè)技術(shù) Y小體檢測(cè)技術(shù),68,X小體檢測(cè)技術(shù),X小體：在間期細(xì)胞核中，由于女性的兩條X染色體中的一條基本處于失活狀態(tài)而形成一種特殊的深染的塊狀結(jié)構(gòu)，稱為X小體。 X小體與X染色體的關(guān)系 用人體的體細(xì)胞，如口腔上皮細(xì)胞或女性個(gè)體的陰道上皮細(xì)胞，通過特異的處理和染色，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞核膜的內(nèi)緣有一塊染色較深、大小為1m左右的呈半月形的小塊，即X小體。有些細(xì)胞中，X小體的位置不在核膜的內(nèi)緣，那就不容易與其他的染色質(zhì)塊區(qū)別了，所以一般只用緊貼于核膜內(nèi)緣的作為陽性。,69,根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)查明一個(gè)分裂間期細(xì)胞核中僅 有一條

31、X染色體呈松散狀態(tài)，參加細(xì)胞生理活 動(dòng)，另一條X染色體則仍保持異固縮的狀態(tài)， 所以染色較深而成為X小體。據(jù)此，正常男性 個(gè)體不可能出現(xiàn)X小體；正常女性可能出現(xiàn)一 個(gè)X小體。其X小體與X染色體的關(guān)系如下 表，即X小體數(shù)目等于X染色體數(shù)目減1。,70,71,口腔粘膜細(xì)胞X小體檢測(cè)法,1、漱口3次，然后以木質(zhì)壓舌板刮取口腔頰部粘膜細(xì)胞，放入盛有生理鹽水的離心管中，搖動(dòng)分散細(xì)胞。 2、用1 000轉(zhuǎn)/分 離心10分鐘，除去上清液，細(xì)胞沉淀物用31的甲醇冰醋酸固定劑固定10分鐘。 3、再用1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，除去上清夜，向細(xì)胞沉淀物中加入幾滴新的3:1的甲醇冰醋酸固定劑制成細(xì)胞懸液。 4、將細(xì)胞懸液滴入載玻片上，讓其在空氣中干燥后，放入5N HCl中處理10分鐘，自來水中漂洗數(shù)秒鐘，放入0.2%甲苯胺藍(lán)染色液中染色11.5分鐘或放入硫堇染色液中染色30分鐘，自來水漂洗，空氣中干燥后，在油鏡下依次觀察細(xì)胞核著色均質(zhì)，核摸完整的細(xì)胞100個(gè)，并計(jì)數(shù)具靠近核膜邊緣的半月形X 小體的細(xì)胞數(shù),72,羊水細(xì)胞X小體檢測(cè)法,從中期妊娠（16周左右）的孕婦中，經(jīng)羊膜穿刺抽取羊水510ml左右，放入離心管中，以1000轉(zhuǎn)/分 離心10分鐘，去上清液，加入3:1甲醇冰醋酸固定劑51