當(dāng)歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究

1、當(dāng)歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究當(dāng)sinensis(oliv.)diels的干燥根.當(dāng)歸根人藥,有補血活血,調(diào)經(jīng)止痛,潤腸通便和調(diào)控免疫活性的功效【21.臨床用量大,出口量大,主產(chǎn)甘肅岷縣,渭源,隴西,宕昌等地i.其主要成分有揮發(fā)油,多糖,阿魏酸等41,此外還含少量鉀,鈣,鎂,鋅,硒等微量元素.近年來,對當(dāng)歸的深度開發(fā)在醫(yī)藥,保健品和化妝品領(lǐng)域取得了一定成效.當(dāng)歸的主要功能成分一直被認(rèn)為是揮發(fā)油和阿魏酸,近年來國內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸還有抗缺氧,抗癌,康膚美容,補血活血,抑菌,抗動脈硬化作用等i51.黃酮是廣泛存在于自然界的一大類化合物,存在于植物的所有部分,包括根,心材,樹皮,葉,果實

2、和花中.其在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類,小部分以游離態(tài)(苷元)的形式存在【.黃酮類化合物大多具有顏色,在生理方面具有降低心肌耗氧量,增加冠狀動脈和腦血管血流量,增加機體免疫功能,抗心律失常,軟化血管,降血糖,降血脂,清除機體自由基和抗衰老等作用i7i.筆者等以甘肅隴南當(dāng)歸為對象,考察其提取工藝及抗氧化性,為當(dāng)歸的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).1材料與方法1.1原料及處理方法當(dāng)歸:采自甘肅隴南.將當(dāng)歸根經(jīng)自來水,蒸餾水洗凈,烘干,粉碎過60目篩,備用.1-2主要試劑鄰苯三酚:美國sigma公司;tris:加拿大biobasic公酸,30%過氧化氫,i氯乙酸(tca),磷酸緩沖液(ph值為7.40

3、,ph值為6.60)(pbs),無水乙醇,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉,三氯化鐵,鐵氰化鉀等試劑均為分析純;試驗用水為三蒸水,所用儀器均經(jīng)自來水,三蒸水清洗備用.1.3主要儀器gb204電子天平:梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司;re一52c型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鞏義市英峪予華儀器廠;shzd(1li)循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;dk一98一型電熱恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;wfj一2100型分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;lambda系列紫外/可見分光光度計:美國perkinelmer公司;800型離心沉淀器:上海手術(shù)器械十廠;yld一2100電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上

4、?，槡瀸嶒炘O(shè)備有限公司.1.4黃酮含量測定原理及鑒定方法1.4.1測定原理黃酮類化合物主要包括黃酮苷和黃酮醇苷兩大部分.在黃酮類化合物溶液中加入鋁離子試劑后,黃酮類化合物中的酚羥基與al生成絡(luò)合物,控制適宜的ph值,所生成的絡(luò)合物在可見區(qū)能獲得特征吸收峰,其質(zhì)量濃度與吸光度符合朗伯一比耳定律,可以定量測定8.1.4.2金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)鹽酸一鋅粉反應(yīng):在樣品液中加入少量鋅粉,再滴加1-2滴濃鹽酸,在沸水中加熱3min,觀察反應(yīng)結(jié)果.鋁鹽反應(yīng):在樣品液中滴加10%a1c1,溶液,觀察反應(yīng)結(jié)果.濃硫酸反應(yīng):在樣品液中滴加少量濃h2so溶液,觀察反應(yīng)結(jié)果.硝酸鉛反應(yīng):在樣品液中滴加10%pb(n

5、o,),溶液,觀察反應(yīng)結(jié)果.氫氧化鈉反應(yīng):在樣品液中滴加4%naoh溶液,觀察反應(yīng)結(jié)果.1.4.3單因素試驗分別以提取溫度,乙醇濃度,提取時間,料液比為影響因素,設(shè)置4個因素的不同水平,以確定相關(guān)因素對當(dāng)歸提取液中總黃酮含量的影響.調(diào)查研究1.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.5.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取105oc常壓干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg,用少量75%乙醇加熱溶解,待冷卻后轉(zhuǎn)移至50ml的容量瓶中,定容至刻度,充分混勻.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.2000rag/me,備用.1.5.2.2測定波長的選擇按上述方法制備標(biāo)準(zhǔn)溶液,以不加標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)溶液為空白,在波長400760nm進行連續(xù)

6、掃描.結(jié)果在波長509nm處有最大吸收,因此選擇509nm為測定波長.1.5.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.o0,0.50,1.o0,1.50,2.o0,2.50,3.o0,3.50ml,分別置于10ml的具塞試管中,先加5%亞硝酸鈉溶液0.40ml,搖勻,靜置6min;再加10%硝酸鋁溶液0.40ml,搖勻,靜置5rain;最后加入4%氫氧化鈉4.o0ml,用75%乙醇定容,搖勻,靜置15rain,以蘆丁試劑空白作參比,用分光光度計于509nrfl處測定吸光度.1.5.3回收率試驗精密量取一定量在最佳提取工藝條件下的當(dāng)歸總黃酮提取液,加入0.2000mg/ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.o0

7、ml,最后定容至10ml.測量吸光度,計算黃酮回收率.1.5.4精密度試驗根據(jù)正交試驗的分析結(jié)果,依照最佳提取工藝進行提取,對當(dāng)歸樣品平行提取5次,測定黃酮含量,計算精密度.1.6體外抗氧化性試驗1.6.i提取液對羥基自由基的清除效果按照smimoff的方法,利用h0與fe”混合,產(chǎn)生?oh,在體系內(nèi)加人水楊酸捕捉?oh,并產(chǎn)生有色物質(zhì),該有色物質(zhì)在510rim下有最大吸收,故通過測定a.值可以定量判斷?oh的清除程度,并可以估算出?oh的清除率.取不同量一定濃度的提取液,加入9.o0mmol/lfeso41.o0ml,9.o0mmojl水楊酸一乙醇溶液1.o0ml,再加8.80mmol/lh

8、:01.o0ml,用蒸餾水補至5.00ml,于37下反應(yīng)30min,以蒸餾水作參比測定a.值(a),以9mmol/lfeso41.o0ml,9.o0mmol/l水楊酸一乙醇溶液1.o0ml,移取一定量提取液,用蒸餾水補至5.o0ml,于37下反應(yīng)30rain作為本底吸收值(a蚰),以9mmo1lfeso1.o0ml,9.o0mmol/l水楊酸一乙醇溶液1.o0ml,蒸餾水1.o0ml,8.80mmo1lh2021.o0ml,用蒸餾水補至5.o0ml,于37下反應(yīng)30rain作為空白(a0),均測定其a,.值.按以下公式計算自由基清除率(c):c(%):ao-(a.x-axo)100a01.6.

9、2提取液對超氧陰離子的抑制作用i111在堿性條件下(ph值8.20)鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),生成02_?和有色中間產(chǎn)物,該有色產(chǎn)物在322nm處有一特征吸收峰.當(dāng)加入0:一?清除劑時,0一?的生成被抑制,鄰苯三酚自氧化速率受阻,溶液在322nm處吸收減弱,故通過測定a值可以推測提取物對02-?的清除作用,并比較不同提取物添加量對02-?清除作用的相對大小.取3支10ml比色管,各加入ph值8.20的trishci溶液2.o0ml,再依次分別加入0.o0,0.50ml一定濃度提取液(le)和0.2mg/ml抗壞血酸溶液0.50ml,最后均加0.2mmol/l鄰苯三酚溶液1.o0ml,加水定容至刻

10、度,在波長322nm處以時間模式記錄45rain內(nèi)每隔30s吸光度的變化.另取10支10ml比色管,各加ph值8.20的trishc1溶液2.o0ml,再依次分別加入0.o0,0.20,0.40,o.60,0.80,1.00,1.20,1.40,1.60,1.80和2.o0ml一定濃度的提取液(le),最后均加0.2mmol/l鄰苯三酚溶液1.o0ml,加水定容至刻度,在波長322ilm處以時間模式記錄5rain內(nèi)每隔30s吸光度的變化,并計算提取液對超氧陰離子自由基的抑制率.抑制率按下式計算:抑制率(%)=(a,t一at)/(a./t)x100式中:a/zxt為鄰苯三酚自氧化速率,at為加入

11、提取物以后鄰苯三酚自氧化速率.1.6.3提取物還原力的測定普魯士蘭法【i2】.吸取不同量一定濃度的提取液,分別加入0.2mol/lph值6.6的磷酸鹽緩沖液和濃度為1%kfe(cn)溶液各2.50ml,混合均勻,混合液在5o水浴中保溫20rain后,加10%的tca溶液2.50ml,混合后3000r/rain離心10rain.取上清液2.50ml,加蒸餾水2.50ml和0.1%feci3溶液0.50ml.測定反應(yīng)液在700am處吸光度值,用吸光度大小表示還原力強度.2結(jié)果與分析2.1黃酮類化合物的鑒定顯色反應(yīng)結(jié)果見表2,表明當(dāng)歸中含有黃酮類化合物.表2顯色反應(yīng)結(jié)果結(jié)果淺黃_橙紅輕微渾濁淺黃亮黃

12、淺黃_+紅褐色淺黃j+向色絮狀沉淀2.2單因素試驗2.2.1料液比的影響準(zhǔn)確稱取1.o000g當(dāng)歸樣品于100ml圓底燒瓶中,在提取溫度為60,提取時間為2h,乙醇濃度為65%,提取次數(shù)為3次條件下,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀,冷卻后定容至100ml容量瓶,分析料液比對提取當(dāng)歸中總黃酮的影響.結(jié)果見圖1.由圖i可以看出,當(dāng)料液比為1:40時,吸光度達到最大值,說明總黃酮含量達到峰值.當(dāng)繼續(xù)增加料液比時,吸光度反而下降,可能是料液比增加到一定程度時,原料內(nèi)部與溶劑之間溶質(zhì)已經(jīng)達到平衡,反而使雜質(zhì)溶解增加,相應(yīng)降低了吸光度值”1.料液比圖1料液比對當(dāng)歸總黃酮提取量影響2.2.2乙醇濃度的影響準(zhǔn)確稱取

13、1.0000g當(dāng)歸樣品于100ml圓底燒瓶中,在提取溫度為60,提取時間為2h,料液比為1:40,提取次數(shù)為3次的條件下,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀,冷卻后定容至100ml容量瓶,分析乙醇濃度對提取當(dāng)歸中總黃酮的影響.結(jié)果見圖2.由圖2可以看出,當(dāng)乙醇濃度為75%時,吸光度達到最大值,說明總黃酮含量達到峰值.當(dāng)繼續(xù)增加乙醇濃度,吸光度反而下降.實驗結(jié)果表明,以75%乙醇進行提取為宜.5505口掣群0_.d0%45%50%55%b0%55%70%75%目0%85%乙醇濃度/%圖2乙醇濃度對當(dāng)歸總黃酮提取量影響2.2.3提取時間影響準(zhǔn)確稱取1.0000g當(dāng)歸樣品于100ml圓底燒瓶中,在乙醇濃度為7

14、5%,提取溫度為60,料液比為l:40,提取次數(shù)為2次的條件下.經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀,冷卻后定容至100ml容量瓶,分析提取時間對提取當(dāng)歸中總黃酮的影響.結(jié)果如圖3所示,隨著提取時間的延長,吸光度逐漸增加,但是3h以后吸光度反而下降.2.2.4實驗04督口42圖3提邱100ml圓料液比為儀濃縮至:溫度對提:以看出,陽度達到類物質(zhì)在高溫下遭到破壞,或者其它雜質(zhì)被提取出來,不利于進一步的分離純化il41.o10203040507o901oo提取溫度/c圖4提取溫度對當(dāng)歸總黃酮提取量影響2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程見圖5.oo01012000005006o07口舶蘆丁濃度/mg-圖5標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線2.

15、4正交試驗采用(3)正交試驗對當(dāng)歸提取液進行分析,以黃酮提取量為指標(biāo),研究各因素間相互作用下的最佳提取工藝.結(jié)果見表3.調(diào)查研究取時間為3.5h,料液比為1:30,提取次數(shù)為2次.在此工藝條件下得到的總黃酮提取量為9.4642mg/g.2.5精密度試驗結(jié)果見表4.表4精密度試驗結(jié)果黃酮含量/rag9.21368.57888.77929.49768.87958.98974.04由表4相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分析可得rsd為4.04%,在此工藝條件下得到的總黃酮提取量高,精密度良好.2.6回收率試驗由表5試驗結(jié)果可得,平均回收率為99.51%,說明該方法的回收率高,適合工業(yè)化生產(chǎn).表5回收率試驗結(jié)果0.623

16、6o.657o0.2769o.26770-3l870.2n20.20.20.2o.8236o.857o0i4769o.46770.5l870.83410.84240.46l50.46320.5300l01_2798_3096.7799.5l99.o3102.132.7體外抗氧化性試驗結(jié)果2.7.1提取液對羥基自由基的清除效果試驗結(jié)果表明,當(dāng)歸黃酮對羥自由基(?oh)的清除率隨著添加量的增加而增加,當(dāng)提取液總黃酮濃度為0.068mg/ml時,清除率可達到74.02%,說明提取液對羥自由基有較好的清除作用.而且總黃酮濃度與清除率基本呈線性相關(guān),見圖6.提取液體積(x)與清除率(y)關(guān)系的回歸方程為

17、:y=一3.904+1175.40107x(r=0.99655)000001o02o03o04o05006007濃度/nagml圖6當(dāng)歸總黃酮提取液對?oh的清除效果2.7.2提取液對超氧陰離子的抑制作用結(jié)果見圖7.由圖7可見,當(dāng)加入一定的提取液后,隨著時間的推移,鄰苯三酚自氧化曲線明顯降低,說明提取液對鄰苯三酚的自氧化有明顯抑制作用.圖7鄰苯三酚自氧化曲線試驗結(jié)果表明,當(dāng)歸黃酮對超氧陰離子(o一?)的清除率隨著添加量的增加而增加,當(dāng)提取液總黃酮濃度為0.034mg/ml時,抑制率可達到51.79%,說明提取液對oz一?有較好的抑制作用,見圖8.且總黃酮濃度(x)與抑制率(y)呈線性相關(guān):y=

18、4.266+1399.25134x(r=o.99558).1/j/j/i.,一000000d口0o23o00,5濃度/ragml圖8當(dāng)歸總黃酮提取液對鄰苯三酚自氧化抑制作用陽帥如仲0*鍾察醉器囂2.7.3提取物還原力測定當(dāng)歸黃酮具有良好的還原能力.圖9結(jié)果表明,隨著提取液加入體積的增大,還原力逐漸增強.當(dāng)加入0.08mg/ml提取液2.o0ml時,吸光度為0.566,說明黃酮是良好的供電子基團.黃酮供應(yīng)的電子除可以使fe還原為fe”,還可以與自由基成為較惰性物質(zhì),以中斷自氧化連鎖反應(yīng).提取液體積(x)與吸光度(y)關(guān)系的回歸方程為:y=0.06013+0.26433x(尺=0.99592)體積/ml圖