現(xiàn)代科技綜述知識文庫：哺乳動物體外發(fā)生

1、現(xiàn)代科技綜述系列哺乳動物體外發(fā)生科技是人類區(qū)別于動物的重要文明之一，是人類對自然規(guī)律研究和利用的學科。本文提供對科技基本概念“哺乳動物體外發(fā)生”的解讀，以供大家了解。哺乳動物體外發(fā)生通過人工將雌性或雄性配子在體外成熟、受精和發(fā)育，這種孕育哺乳動物新的生命開端的方法。當前只能使合子體外發(fā)育到胚泡(囊胚)，要完成胎兒發(fā)育的全程，還需移入受體母親的子宮。由此而誕生的新生幼仔叫試管動物，人則稱試管嬰兒(Test-tebe Baby)。體外發(fā)生的主要意義是能充分挖掘良種母畜的生殖潛力，提供豐富的卵源，培育新的生命；不僅是擴大珍稀瀕危動物繁殖的新途徑，也是人類不育癥患者的福音，民族優(yōu)生的有效手段。其主要內(nèi)

2、容是卵細胞體外成熟，培養(yǎng)條件的優(yōu)化，精子獲能；體外受精和體外發(fā)育等。早在1878年維也納的Schenk首先報導培養(yǎng)卵子的工作，但體外受精未獲成功。1912年Mark等進行小白鼠的培養(yǎng)，結(jié)果進展不佳。衡量培養(yǎng)效果的標志是卵子的存活力和發(fā)育狀況，而其影響的關(guān)鍵因素是培養(yǎng)條件與方法。及至50年代前后，在培養(yǎng)基、培養(yǎng)系統(tǒng)上有了較大的改進，從而取得了明顯的進展。Chang(1946)、Hamnond(1949)的主要貢獻是發(fā)現(xiàn)應(yīng)向生理鹽溶液中添加適量的血清或蛋白，補償了酸性pH值，使體外卵裂成功。Whitten(1956、1957)的最大成就是指明應(yīng)提供的氣相條件是5%CO2與空氣或氮，而不是CO2與氧

3、的混合氣體。Yanagimachi(1963)的貢獻是用液體石蠟復蓋培養(yǎng)基液面以穩(wěn)定pH和滲透壓。Brinster(1963)的貢獻是發(fā)現(xiàn)剛受精的卵不能利用復雜碳水化合物應(yīng)以丙酮酸鹽或乳酸鹽代替葡萄糖。由于早前的出色成就，Whittingham(1968、1976)取得小白鼠卵體外受精、體外發(fā)育到胚泡而后再移植成功。Dorfman(1969)培養(yǎng)殖大白鼠卵成功。早期發(fā)現(xiàn)牛血清對牛胚有致毒作用，Rowson等(1969)應(yīng)用TCM199合成培養(yǎng)基體外培養(yǎng)牛胚并移植成功。實踐證明，要使哺乳動物胚胎體外培養(yǎng)并移植成功，必須選用鉀、鈉、鈣鹽平衡，滲透壓適宜的碳酸氫緩沖液，補加血清或蛋白；抗生素，對剛受

4、精卵應(yīng)以丙酮酸鹽或乳酸鹽作能源，以液蠟復蓋液面，并有穩(wěn)定的5%CO2、空氣或氮的混合氣相培養(yǎng)系統(tǒng)。胚胎體外培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)無疑為卵母細胞體外成熟和受精提供有益的經(jīng)驗。Pincus(1939)取人卵巢未成熟卵體外培養(yǎng)到產(chǎn)生第一極體。1955年Chang培養(yǎng)免卵巢濾泡卵母細胞至第一極體出現(xiàn)；1957年發(fā)現(xiàn)精子獲能的規(guī)律；1959年他將由供體輸卵管采到的卵母細胞，在體外用獲能精子受精體外發(fā)育后移植給受體，得到了成活的仔免。從此人們開始相信哺乳動物精子入卵前必須獲能，獲能才能參與受精，受精可在體外完成的事實。體外受精的技術(shù)得以迅猛發(fā)展，先后已有20種實驗動物和家畜取得體外受精成功，10多種獲得試管個體。

5、Edwards(1978)等成功地獲得世界上第1個“試管嬰兒”布朗路伊絲(Louise Brown)，Bracktt(1982)獲得第1頭“試管?！?，Balmaceda(1984)獲得“試管獼猴”，日本花田章(1985)獲得“試管羊”等?，F(xiàn)在哺乳動物體外發(fā)生的研究已在世界許多國家開展并應(yīng)用，進展比較迅速。關(guān)于對濾泡卵母細胞(簡稱卵泡卵，是卵巢中尚未成熟排放的卵)的研究利用，早期人們僅作探索性的研究，體外培養(yǎng)進展到初級卵母細胞階段。但廣為研究和利用是在家兔體外發(fā)生成功之后。采集卵泡有以下幾種途徑：自然發(fā)情母畜的輸卵管；自然發(fā)情或人工誘導發(fā)情母畜卵巢成熟的濾泡和屠宰母畜卵巢未成熟或行將閉鎖的濾泡。

6、前兩種途徑采到的卵泡卵已是成熟或正在成熟的卵子，體外受精不需要培養(yǎng)或稍事培養(yǎng)即行。取得體外發(fā)生和移植成功的有小白鼠(Makherjee，1972)，兔(Brackett，1973)和人。但是由未成熟或閉鎖濾泡中啄出的卵泡卵行體外受精時必須經(jīng)體外成熟培養(yǎng)，這個過程是指將生發(fā)泡破裂前的初級卵母細胞，在特定的條件下培養(yǎng)到第一極體排出，并進入第2次成熟分裂中期。人工培養(yǎng)卵泡卵，無論在培養(yǎng)液、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)系統(tǒng)上都與同類早期胚胎的培養(yǎng)程序相似，但所不同的是卵泡卵體外成熟要在培養(yǎng)液中添加適量的激素，因為它在體內(nèi)自然成熟過程是受其調(diào)控的，所以人工模擬成熟要加FSH和LH，此外有人添加雌二醇，PMSGHGG

7、和催乳素的。近期還有人另加卵巢濾泡細胞或輸卵管上皮細胞與卵泡卵進行共培養(yǎng)。已經(jīng)取得卵母細胞體外成熟的有小白鼠(Cross等，1970)、免(Motlik，1974)、牛(Shea等，1976；parrish等，1986)、羊(Moor等，1977；Staigmiller等，1984)和馬(Fulk等，1981)等。卵母細胞體外受精存在一定的難度，為了簡化其復雜程序，人們把體外成熟的卵母細胞移入已交配的母畜子宮，使之體內(nèi)受精發(fā)育，然后再回收用于移植，取得成功的有兔、牛、羊和豬等。體外成熟的卵泡卵在體外或體內(nèi)都能正常受精和發(fā)育和事實，這就為利用卵泡卵代替輸卵管奠定基礎(chǔ)。從體外發(fā)生的發(fā)展遠景來看，這

8、是一項十分重要的研究領(lǐng)域，因為可以更好利用屠宰或老殘母畜的卵巢，不僅可以更充分地挖掘家養(yǎng)母畜的繁殖能力。而且有望解決難以獲得的珍稀瀕危野生動物的卵源。利用卵巢，乃是一個十分豐富、經(jīng)濟而又重要的卵庫。哺乳動物體外發(fā)生的主要條件是精子的成熟和獲能。和低等脊椎動物不同，魚類、兩棲類動物的卵子和精子可以在體外直接接觸，完成受精，而哺乳動物直接射出的或由附睪中采出的精子不能體外受精，只有當這些精子在雌性殖道內(nèi)停留一段時間之后取出來才能完成體外受精。這一現(xiàn)象是Chang和Austin(1951)發(fā)現(xiàn)的。精子在存留期間形態(tài)和生理上發(fā)生了一系列的變化，才獲得與卵子結(jié)合的能力，Austin將此現(xiàn)象叫“精子獲能”

9、。人們了解，精子是在雌性生殖道的旅程中獲能的，獲能起始于子宮而完成于輸卵管，輸卵管是最有效的獲能部位。精液射入陰道的動物(兔)，獲能部位始于陰道。精子在發(fā)情母畜體內(nèi)獲能完成較快。但在休情母畜體內(nèi)較慢。人們還了解：體外受精必須用成熟的精子，成熟的精子才能獲能。成熟的精子應(yīng)取自射出的或附睪尾部，附睪頭部的精子尚未成熟，不能獲能。Chang等(1975)發(fā)現(xiàn)，哺乳動物精子獲能無種的特異性，如濾泡、眼前房等組織器官液也能使精子獲能。獲能的精子如與精液再混合，便會發(fā)生去能，去能精子還可再次獲能，可見體內(nèi)獲能是一個非常9復雜的過程。至于精子能否在體外獲能?回答已是肯定的了。早期，人們曾用-淀粉酶，仙臺病毒

10、用于家兔；濾泡液、血清用于倉鼠；環(huán)腺苷酸用于大白鼠精子體外獲能。其后發(fā)現(xiàn)人工合成液可使動物精子體外獲能，近年來，人們用Ca+載體對山羊，用肝素、胺基葡萄糖對牛的精子體外獲能均有成效，近期還有人用改變培養(yǎng)液的H+濃度或滲透壓使精子體外獲能，取得顯著效果。哺乳動物體外發(fā)生有其十分復雜的過程，研究難度過極大，時至90年代，雖已取得不少突破性進展，但仍處于試驗階段。展望未來，從生殖工程和遺傳工程的發(fā)展動向，從畜牧生產(chǎn)、臨床醫(yī)學和人類優(yōu)生的應(yīng)用趨勢，它仍是一個極為重要和十分活躍的研究領(lǐng)域。體外成熟的卵母細胞和體外獲能的精子不如自然的受精率高；對卵泡卵尚未達到充分利用，有待在研究條件和方法上的改進和提高。

11、哺乳動物受精是一個特別復雜的問題，弄清精子體外獲能的機理有利受精機理的解決。腹窺鏡和B超等先進手段正走入試管動物的臨床研究，不僅對家畜繁殖而且對珍稀瀕危野生動物的增殖和保護都有積極意義。日本三浦猛(1989)試管培養(yǎng)鱔魚精子成功，這是精母細胞體外成熟的首次突破，引起人們的極大興趣與關(guān)注，這一成果的應(yīng)用，對家畜和瀕危動物的人工繁殖將起主動作用，也是男性不育癥患者的特大喜訊?！緟⒖嘉墨I】： 1 Whitten WK. Culture of tubal mouse ova.Nature. 1956. 177:96 2 Chang MC. Fertilization of rabbit ova in

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