（2羧乙基）殼聚糖的制備及其抑菌性能

1、（2-羧乙基）殼聚糖的制備及其抑菌性能第28卷第9期2011年9月應(yīng)用化學(xué)chinesejournalofappuedchemistryv01.28iss.9sep.2011季銨化,d-(2一羧乙基)殼聚糖的制備及其抑茵性能蔡照勝孫岳明楊春生朱雪梅(.東南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院南京211189;鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鹽城)摘要以縮水甘油基三甲基氯化銨(gtma),縮水甘油基三乙基氯化銨(gtea),縮水甘油基三丙基氯化銨(gtpa),縮水甘油基三丁基氯化銨(gtba)和縮水甘油基二甲基芐基氯化銨(gdmba)等活性季銨鹽為季銨化試劑,對n,0-2一羧乙基殼聚糖(n,0-2一cec)進行了

2、化學(xué)改性,得到了系列季銨化n,o一2一cec(qcecs);用電位滴定法測定了qcecs的季銨化度(dq),分光光度法測定了n,0-2一cec和qcecs的等電點(ph);用瓊脂平板法測定了n,0-2一cec及其季銨化衍生物對金黃色葡萄球菌(s.aureu)和大腸桿菌(e.coli)的最低抑菌濃度(mic值),并根據(jù)n,o一2一cec及其季銨化衍生物對這2種微生物的mic值評價了它們的抗菌活性.結(jié)果表明,實驗條件下得到的qcecs的dq值在51.3%一59.1%間;,0-2-cec及其季銨化產(chǎn)物的等電點在6.447.30間,且季銨基團的引入會導(dǎo)致ph.增大;除gtma改性n,o一2一cec的產(chǎn)

3、物外,其它qcecs的ph隨其季銨化度提高都有所增大;,0-2.cec和qcecs對saurell和正coli均具有抗菌活性,且qcecs的mic值均低于n,0-2一cec的mic值;同時,季銨基團中烴基碳數(shù)的增加及二甲基芐基結(jié)構(gòu)的存在可提高qcecs的抑菌能力.關(guān)鍵詞n,o一(羧乙基)殼聚糖,季銨化改性,等電點,最小抑菌濃度中圖分類號:0636.1文獻標(biāo)識碼:a文章編號:1000-0518(2011)09-1017-05doi:l0.3724/sp.j.1095.2011.00489n,o一(2一羧乙基)殼聚糖(n,0-2-cec)是殼聚糖(cts)由3一氯丙酸進行羧乙基化改性得到的衍生物,

4、在廢水處理,藥物控制釋放和食品保存中有重要應(yīng)用l引.但由于羧烷基殼聚糖在水溶液中更多地呈現(xiàn)陰離子高分子電解質(zhì)的特征,使其應(yīng)用受到一定限制.用季銨化試劑改性n,o一羧甲基殼聚糖(,ocmc)已有報道h.由于n,0-2一cec的結(jié)構(gòu)類似于n,0.cmc,因此對其進行季銨化改性,可以得到分子中既有羧基,又有季銨基團的兩性高分子電解質(zhì)季銨化羧乙基殼聚糖(qcecs).作為殼聚糖的一種新型衍生物,qcecs不但對金屬陽離子有較強螯合力,而且對表面呈負電性的微生物細胞膜也有很強結(jié)合能力,可使qcecs有典型季銨鹽的抑菌性能.因此,cec的季銨化改性對進一步拓寬殼聚糖在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用有重要價值.本研究對

5、n,o一(2-羧乙基)殼聚糖(n,0-2一cec)進行了季銨化改性,測試了它們在水溶液中的等電點和抑菌性能.與文獻刮相比,本研究通過對殼聚糖衍生物在水溶液中等電點行為的考察,可以更好地確定這些殼聚糖衍生物的典型應(yīng)用條件;同時,通過季銨基團結(jié)構(gòu)對qcecs抑菌性能影響的研究,可以為有選擇性地對n,0-2.cec進行季銨化改性以制備高抑菌活性的殼聚糖基生物材料提供指導(dǎo).由cts制備qcecs的反應(yīng)式如scheme1所示.n0-2.cec2010-08-23收稿,201010-30修回國家973基礎(chǔ)研究項目資助(2007cb936300);江蘇省自然科學(xué)基金項目資助(bk2009293)通訊聯(lián)系人:

6、孫岳明,教授;telfaxemail:;研究方向:光電功能材料,線性光學(xué)材料及天然高分子化學(xué)利用應(yīng)用化學(xué)第28卷-or-/orzor,/_orqcecsscheme1synthesisofcarboxyethylchitosanandquatemizedcarboxyethylchitosanr=horcoch3;r=ch2ch2cooh;r=ch2ch(oh)ch2nrlr2r3c1;qcecl:rl=r2=r3=ch3;qcec2:r1=r2:r3=ch2ch3;qcec3:rl=r2=r,=ch2ch2ch

7、3;qcec4:rl=rs=ch2ch2ch2ch3;qcec5:rj=r2=ch3,r3=ch2c6h51實驗部分1.1試劑和儀器n,0.2一cec參照文獻1制備,羧乙基化度(ds)為72.3%(ph滴定法測定),質(zhì)均相對分子質(zhì)量(mw)為3.4710;環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(gtma),環(huán)氧丙基三乙基氯化銨(gtea),環(huán)氧丙基三丙基氯化銨(gtpa),環(huán)氧丙基三丁基氯化銨(gtba)和環(huán)氧丙基二甲基芐基氯化銨(gdmba)水溶液:均參照文獻4,6-7方法制備,其含量分別為49.56%,53.13%,51.83%,54.19%和55.27%(離子色譜法測定);其它試劑均為分析純.dds-11

8、a型數(shù)字電導(dǎo)率儀(上海偉業(yè)儀器廠);water-208型凝膠滲透色譜儀(美國waters公司);phs-3c型精密ph計(上海日島科學(xué)儀器有限公司);nicoletir.360型ffi一ir光譜儀(美國),kbr壓片法;drxs00和av300型nmr譜儀(瑞士bruker公司),d:o溶劑,tms內(nèi)標(biāo);uv-9200型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司).1.2季銨化,d-(2-羧乙基)殼聚糖(qcecs)的制備室溫下將n,0-2-cec溶于蒸餾水中后,再在30min內(nèi)緩慢滴加計量的環(huán)氧丙基三烷基氯化銨溶液,并不斷用naoh溶液調(diào)節(jié)物料ph值至9.0左右,水浴加熱80.0oc反應(yīng)24.

9、0h.用稀鹽酸調(diào)節(jié)物料ph值至2.0左右繼續(xù)反應(yīng)2.0h.物料經(jīng)濃縮后,攪拌下按體積比1:8加到無水乙醇中,析出大量絮狀物.抽濾,無水乙醇浸泡并研磨(反復(fù)3次),得粒狀或纖維狀固體,真空干燥器中干燥,得qcecs.將qcecs樣品溶于雙蒸水中,充分?jǐn)嚢栊纬删蝗芤?向溶液中滴加標(biāo)準(zhǔn)agno溶液,作出qcecs溶液電導(dǎo)率隨標(biāo)準(zhǔn)agno,溶液量的變化曲線,根據(jù)電導(dǎo)率達最低值時對應(yīng)的agno,溶液體積,用下式計算qcecs的季銨化度dq.dq(%)=帚x100(1)式中,為agn()3標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(movl):203為乙酰氨基葡萄糖單元(gicnac)的相對分子質(zhì)量(g/too1);42為glcna

10、c與氨基葡萄糖單元(glcn)的相對分子質(zhì)量之差(g/too1);ds為n,0-2一cec的羧乙基化取代度;為酸式羧乙基的相對分子質(zhì)量(g/mo1);m為測定季銨化度的qcecs的質(zhì)量(g);為qcecs中季銨基團的相對分子質(zhì)量(g/mo1);v1為qcecs溶液電導(dǎo)率達最低值時對應(yīng)的agno.溶液體積(l);為滴定蒸餾水并使其電導(dǎo)率達最低值時對應(yīng)的agno,溶液體積(l);dd為殼聚糖的脫乙酰度.用gpc法測定qcecs的重均分子量,測定條件:凝膠色譜柱,tskgelg3000pwxl(300mm7.8ram);0.7%naso水溶液為流動相,流速0.5mlmmin;柱溫30;進樣量為20;

11、相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為系列標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖.1.3等電點的測定等電點反映兩性電解質(zhì)在水溶液中以偶極離子形式存在時所對應(yīng)的ph值,在溶液的ph值與兩性電解質(zhì)的等電點相等時,兩性電解質(zhì)在水溶液中的溶解度最小,其混懸液在540nm波長處出現(xiàn)最大吸收(abs).稱取0.10gn,0-2-cec或其季銨化產(chǎn)物,分別溶于50ml蒸餾水中,磁力攪拌下用0.10mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)ph值至3.0左右.用0.10mol/lnaoh溶液滴定,并精確測定溶液的ph值,測定該ph值時溶液在540nm的吸光率(abs)值,做abs-ph曲線,曲線上abs最高值時對應(yīng)的ph值即第9期蔡照勝等:季銨化n,o-(2?羧乙基)殼聚糖的制

12、備及其抑菌性能為殼聚糖衍生物的等電點(ph).1.4最小抑菌濃度測定用瓊脂平板法測定n,0-2一cec及qcecs對e.coli和s.aureus的最小抑菌濃度(mic).將樣品溶解并配制成濃度(w/v)為o.5g/l溶液,121oc下滅菌30min;按2倍稀釋法或l0倍稀釋法將溶液加到營養(yǎng)肉湯中,并制成營養(yǎng)瓊脂平板.將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種在營養(yǎng)瓊脂平板上,37下孵化48h;通過菌落數(shù)的變化確定mic值.2結(jié)果和討論2.1qcecs的波譜表征n,0-2一cec和qcecs的fi1一ir圖見圖1.其中qcec1,qcec2,qcec3,qcec4和qcec5分別為gtma,gtea,

13、gtpa,gtba和gdmba為季銨化試劑改性n,0-2一cec生成的產(chǎn)物.在n,0-2一cec的frir圖中,1569和1411cm處為羧酸基(一co)的吸收峰.在qcec1qcec5的ft?ir圖中,反映一co的吸收峰分別出現(xiàn)在1571和1409cm,1569和1410cm,1572和1413cm-.,1571和1411cm,1570和1414cm處;同時,qcec1qcec5分別在1457,1455,1460,1461和1453cm出現(xiàn)了反映引進的季銨基團中甲基ch彎曲振動吸收峰.這說明qcec1qcec5是一種既有羧基又有季銨基團的兩性殼聚糖衍生物./cnl圖1n,0-2一cec和qc

14、ecs的ftir圖fig.1fi-irspectraofn,o一2一cecandqcecsn,0-2一cec及qcecs的hnmr分析結(jié)果及其歸屬見表1.由表1也可知,qcecs是一種既有2一羧乙基,又有含羥丙基的季銨基團的殼聚糖衍生物.表1n,0-2.cec及qcecs的hnmr分析結(jié)果及歸屬table1hnmrresultsofn,0-2-cecandqcecsandtheirascriptionscompoundchemicalshift8/1061.95(ch3c0nh一),2.272.44(nch2ch2co2h),2.59(0一ch2ch2c02h),2.90(snc2h),3.2

15、04.1(snc3,c4andc5h,nch2ch2co2h),4.41(snclh,0一ch2ch2co2h)3.15(ch3),2.29,2.93(nch2ch2co2h),2.4o2.55(ch2ch(oh)ch2,snc2h),3.593.80,3.85-4.1(ch2ch(oh)ch2,0一ch2ch2co2h)1.49(ch3ch2),2.51(ch2ch(oh)ch2,snc2h),2.97(nch2ch2c02h),3.643.91,3.954.2(ch2ch(oh)ch2,0一ch2ch2co2h)qcec31.49(ch3ch2ch2),2.202.70(ch2ch2co2

16、h,snh),2.803.20(ch3ch2ch2,ch2ch2co2h),3.204.20(ch2ch(oh)ch2,0一ch2ch2co2h,snh),1.902.10(ch3conh)qceca1.45(ch3ch2ch2ch2),2.92(ch2ch2co2h),2.45(ch2ch(oh)ch2),3.253.70,4.204.50(ch2crt(oh)ch2,ch2ch2co2h)qcec56.97(arh),4.2-4.5(arch2,ch2ch2co2h),2.64(ch2ch(oh)ch2),2.92(ch2ch2co2h),3.343.39(ch2ch(oh)ch2)?de

17、notedthecarbonofhsituation.n?oro-denotedthesubstitution0ccudinnor0atomofchitosan.respectively.sndenotedthesugarunit.2.2qcecs的季銨化度,等電點和其最低抑菌濃度殼聚糖衍生物的季銨化度,等電點及mic值測定結(jié)果見表2.由表2可知,n,0-2一cec中引進季銨基團得到的qcecs,其ph_ep值相對于n,0-2一cec均有一定提高,且除qcec1外,qcecs的季銨化度越高,其phi.值越大.這是由季銨基團引進到n,0-2一cec中,所得產(chǎn)物帶有更多的正電性基團,要使相應(yīng)產(chǎn)物在

18、水溶液中形成偶極離子,就需更多的羧基轉(zhuǎn)化為-co;造成的.qcec1的dq值最高,而ph卸值c2cc應(yīng)用化學(xué)第28卷相對較小的原因可能與gtma的季銨結(jié)構(gòu)空間位阻小,在n,0-2一cec的季銨化過程中主要進行了氨基或胺基的季銨化,而氨基或胺基上引進了含羥丙基結(jié)構(gòu)的季銨基團后會增強n的給電子性有關(guān).表2殼聚糖衍生物的羧乙基化度,季銨化度,等電點及mic值table2dq,phkpandmicvaluesofchitosanderivatives由表2還可知,與文獻5報道的季銨化羧甲基殼聚糖(qcmc)相類似,n,0-2-cec和qcecs無論對s.aureus還是對ecoli,均具有抑制活性,且

19、對s.aureu.q的抑菌活性大于對e.coli的抑菌活性,但qcecs的抑菌活性均好于qcmc;qcecs的抑菌活性優(yōu)于n,0-2一cec;在相同羧乙基化度和相近季銨化度時,季銨基團中烷基碳數(shù)的增加對提高qcecs的抑菌活性是有利的,且二甲基芐基的存在更有利于改善qcecs的抑菌活性,其原因可能與以下幾方面因素有關(guān).:1)羧乙基的親脂性大于羧甲基,因而其對微生物結(jié)構(gòu)中具有部分親脂性的細胞膜的結(jié)合能力更好;2)n,0-2一cec及其季銨化產(chǎn)物都能夠螯合微生物生長過程中所必需的酶中某些微量金屬離子,從而影響酶的活性并抑制微生物的生長;3)季銨化n,0-2一cec中的季銨基團有利于其吸附于微生物帶

20、負電的細胞膜上,而且其結(jié)構(gòu)中的季銨基團與羧基在抗菌活性上存在協(xié)同效應(yīng),使季銨化n,0-2一cec顯示出更好的抗菌活性,這也使本研究中報道的qcec2,qcec3,qcec4或qcec5的抑菌能力,尤其是qcec5的抑菌能力,明顯優(yōu)于文獻5中報道的qcmc;4)s.aure是一種典型的革蘭氏陽性菌,共細胞膜是由多孔的肽聚糖構(gòu)成,外來分子進入細胞內(nèi)相對較容易;而e.coli是一種典型的革蘭氏陰性菌,其細胞膜是由肽聚糖內(nèi)層和由脂多糖,脂蛋白及磷脂構(gòu)成的外層組成,這種雙層結(jié)構(gòu)不利于外來分子進入;5)季銨基團中烴基碳數(shù)的增加可以增強季銨化n,0-2一cec在細胞膜上的吸附能力,芐基的存在可以使季銨化n,

21、0-2一cec與微生物的結(jié)合能力進一步提高,從而使微生物的正?；顒痈菀资艿较拗?并使微生物細胞膜更易破裂而引起其細胞內(nèi)容物泄漏死亡.3結(jié)論殼聚糖經(jīng)3.氯丙酸改性后生成的n,0-2-cec及再用環(huán)氧丙基三烷基氯化銨季銨化改性的n,0-2一cec(qcecs),無論對s.aureus還是對e.coli均具有抑菌活性,并且季銨化qcecs的抑菌活性優(yōu)于,o-2一cec;季銨基團中烴基碳數(shù)的增加以及二甲基芐基的存在更有利于改善季銨化n,0-2一cec的抑菌能力.n,0-2一cec經(jīng)活性季銨化試劑改性后,生成的qcecs的等電點比n,o.2一cec有一定提高.參考文獻1caizhaosheng,son

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30、idyltriethylammoniumchloride(gtea),glycidyltripropylammoniumchloride(gtpa),glycidyltributylammoniumchloride(gtba)andglycidyldimethylbenzylammoniumchloride(gdmba).substitutiondegreeofquaternization(dq)ofqcecswasdeterminedbythepotentiometry,inwhichthevariationsofpotentialofsolutionwiththevolumeofagno3aqueoussolutionweremeasured.theisoeletricpoints(phi.)ofn,0-2一cecand