ELISA檢測(cè)技術(shù)

1、.,1,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA),ELISA技術(shù)簡(jiǎn)介,ELISA的基本原理,ELISA的類型和方法,ELISA方法注意事項(xiàng)和應(yīng)用,.,2,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原-抗體反應(yīng)的特異性和等比例性，是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附（包被）在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板，也稱酶標(biāo)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，加入相應(yīng)的酶底物后發(fā)生顏色反應(yīng)，通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反

2、應(yīng)，通過(guò)顏色反應(yīng)的深淺檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原含量的檢測(cè)技術(shù) 。,.,3,ELISA的發(fā)展概況,自從Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）以來(lái)，由于ELISA技術(shù)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用 。 隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，將利用基因工程技術(shù)制備的抗原或單克隆抗體包被酶標(biāo)板后，極大地提高了ELISA檢測(cè)技術(shù)的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測(cè)儀的使用，使ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法之一。 目前，ELISA檢測(cè)技術(shù)在科學(xué)研究、疾病診斷、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)等諸多領(lǐng)域廣

3、泛應(yīng)用。,.,4,ELISA的基本原理,酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。,基本原理,.,5,ELISA試劑盒的組成,完整的ELISA試劑

4、盒通常包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（俗稱酶標(biāo)板）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）；（3）酶的底物；（4）參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量試劑盒）及其稀釋液；（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；（6）洗滌液（通常為濃縮液，用前按比例稀釋）；（7）反應(yīng)終止液； （8）封口膜若干、說(shuō)明書(shū)一份。,.,6,酶標(biāo)板,.,7,ELISA常用酶類,辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP),DH2+ H2O2 D + H2O上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。,常用底物： 1. 鄰苯二胺(OPD)，產(chǎn)物為橙紅色（492nm檢測(cè)）； 2. 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，產(chǎn)物為藍(lán)

5、色，酸性條件下變?yōu)?黃色（450nm檢測(cè)）。,反應(yīng)終止液：HCl或H2SO4溶液。,.,8,堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP),常用底物： 1. 對(duì)硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚 （405nm檢測(cè)）； 2. 發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于熒光測(cè)定，靈敏度高于顯色底物的方法。,反應(yīng)終止液：NaOH 溶液。,.,9,ELISA所需儀器設(shè)備,恒溫箱,洗板機(jī),酶標(biāo)儀,.,10,ELISA的類型和方法,半定量ELISA試驗(yàn),定量ELISA試驗(yàn),試驗(yàn)?zāi)康?試驗(yàn)性質(zhì),間接法,雙抗夾心法 (直接夾心法),BAS-ELISA,雙夾心法 (間接夾心法),

6、競(jìng)爭(zhēng)法ELISA,直接法,.,11,直接法ELISA是將酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量（見(jiàn)后圖） 。該方法可用于檢測(cè)抗體或抗原。,直接法ELISA,優(yōu)點(diǎn): 1. 特異性高、準(zhǔn)確性好； 2. 實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短。,缺點(diǎn): 1. 應(yīng)用范圍較小，生產(chǎn)難度大。 需制備各種酶標(biāo)抗原或抗體。,.,12,間接法ELISA,間接法ELISA是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反映一抗和抗原

7、的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量（見(jiàn)后圖）。 該方法可用于抗體檢測(cè)，是目前檢測(cè)抗體最常用的ELISA方法。,優(yōu)點(diǎn): 1. 適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體; 2. 制備方便，價(jià)格便宜。,.,13,雙抗夾心法ELISA,雙抗夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，在用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出捕獲的抗原量，本方法也稱為直接夾心法（見(jiàn)后圖） 。 該方法可用于抗原檢測(cè)，例如細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒等，是目前檢測(cè)抗原最常用的ELISA方法。,優(yōu)點(diǎn): 1. 適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。 2. 制備方便

8、，價(jià)格便宜。,.,14,雙夾心法ELISA,雙夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，然后用未標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-未標(biāo)記抗體復(fù)合物；再應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原-未標(biāo)記抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-未標(biāo)記抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，也稱為間接夾心法（見(jiàn)后圖）。 該方法可用于抗原檢測(cè)，例如蛋白質(zhì)、病原體等。,優(yōu)點(diǎn): 1. 靈敏度高。 2. 制備方便，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。,缺點(diǎn): 實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜。,.,15,.,16,BAS-ELISA,BAS-ELISA即生物素-親和素系統(tǒng)（biotin avidin system, BAS）ELISA法：是先將抗體包被在酶標(biāo)板上，用

9、于捕獲抗原，然后用生物素（biotin）標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體復(fù)合物，再依次加入親和素、酶標(biāo)記生物素（或直接加入酶標(biāo)記的親和素），最后加底物顯色。 生物素是一種生長(zhǎng)因子，廣泛分布于動(dòng)、植物體內(nèi)，又稱輔酶R或維生素H。親和素由四個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素具有高度親和力，即一個(gè)親和素可以結(jié)合4個(gè)生物素分子。因此，本方法具有信號(hào)放大功能（特點(diǎn)）。 該方法可用于抗原、抗體以及DNA和RNA（生物素）檢測(cè)。,.,17,BAS-ELISA實(shí)驗(yàn)原理,.,18,競(jìng)爭(zhēng)法ELISA,競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的實(shí)驗(yàn)原理：將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在對(duì)照孔中加入已知濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品

10、溶液和酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗原）；在測(cè)定孔中同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待檢樣本（抗原），酶標(biāo)抗原和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒(méi)有吸附的酶標(biāo)抗原通過(guò)洗滌去除，加入底物后，復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物。當(dāng)測(cè)定孔內(nèi)的樣本不含抗原時(shí)，固相上的抗體將和酶標(biāo)抗原結(jié)合，加入底物后顯色較深；當(dāng)樣本含有抗原時(shí)，樣本中的抗原和酶標(biāo)抗原共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。酶標(biāo)抗原結(jié)合的比例越高，說(shuō)明結(jié)合在固相抗體上的待測(cè)抗原就越少，反之亦然；在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量，從而進(jìn)一步得知樣本中抗原的多少。,.,

11、19,測(cè)定孔,酶標(biāo)記物,底物溶液,對(duì)照孔,酶標(biāo)記物,底物溶液,參考液(不含抗原),樣本(含抗原),競(jìng)爭(zhēng)法ELISA實(shí)驗(yàn)原理,.,20,半定量ELISA試驗(yàn),.,21,間接法檢測(cè)血清HBsAb含量,設(shè)計(jì)加板次序 (空孔、陰、陽(yáng)),加板 (陰、陽(yáng)、樣),37, 30min,加酶標(biāo)抗體 (空孔除外),洗滌3次，拍干,加底物溶液 (空孔除外),37, 10-30min,加終止液 (空孔除外),避光,上機(jī)檢測(cè)、結(jié)果判定 (空孔調(diào)零),37, 30min,洗滌3次，拍干,.,22,雙抗夾心法檢測(cè)血清IL-2含量,設(shè)計(jì)加板次序 (空孔、陰、陽(yáng)、標(biāo)準(zhǔn)),加板 (陰、陽(yáng)、標(biāo)準(zhǔn)、樣),37, 30min,加酶標(biāo)抗體 (空孔除外),洗滌3次, 拍干,加底物溶液 (空孔除外),37, 10-30min,加終止液 (空孔除外),避光,上機(jī)檢測(cè)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 (空孔調(diào)零),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上 讀取樣品含量,37, 30min,洗滌3次, 拍干,.,23,ELISA試驗(yàn)中的注意事項(xiàng),必須設(shè)立陽(yáng)性、陰性和空孔對(duì)照孔，控制試驗(yàn)條件并檢驗(yàn)試劑盒的質(zhì)量；,待測(cè)樣品應(yīng)設(shè)立雙復(fù)孔或三復(fù)孔；,半定量（或定性）ELISA中結(jié)果判斷依據(jù)通常為： OD樣/OD陰2.1時(shí)為陽(yáng)性結(jié)果，2.1時(shí)為陰性；,酶標(biāo)板洗滌時(shí)確保洗滌干凈，避免假陽(yáng)性；,定量ELISA中每一