【管理精品】2003上海市自然科學基金項目課題申請書：谷氨酸轉運體差異表達與腦缺血后癲癇關系的實驗研究

1、學科代碼0303上海市自然科學基金項目課 題 申 請 書（2003版） 課題編號 課題名稱 谷氨酸轉運體差異表達與腦缺血后癲癇關系的實驗研究 起止年月 2003年11月2006年11月 依托單位 上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院 （蓋章） 通訊地址 上海市山東中路145號 聯系電話 郵政編碼 200001 課題責任人 邱永明 手 機 email 上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院 1001235909008905658開戶銀行 022539黃埔支行南分2003年 9月 1日訂填 寫 說 明一、填寫申請書前，申請者應閱讀當年的上海市自然科學基金項目申報通知。二、課題

2、申請者應根據要求逐條認真編寫，表達要明確、嚴謹。外來語同時用原文和中文表達。三、本課題申請書編寫請使用a4紙雙面印刷,請不要采用膠圈、文件夾等帶有突出棱邊的裝訂方式，請采用普通紙質材料作為封面。請用計算機打印填報，各欄空格不夠時，請自行加頁。四、本課題申請書填寫后，按隸屬關系審批上報市科委一式六份。五、本申請書經正式審定后，即作為合同的附件，附于合同的正副文本之中。六、請在申請書封面上“學科代碼”處填寫學科代碼。例如：“金屬材料學科”則填寫“e0100”。七、本提綱制訂單位是上海市科學技術委員會。填寫簡表注意事項1課題名稱：要確切反映申請資助的研究工作內容（限20字）。2凡有多個的選擇性欄目，

3、請將所選項前的打，且只能選擇一項。3學科代碼：填寫本研究課題所屬學科。學科代碼表a 數理科學0100數學，0200力學，0300天文學，0400物理學i(凝聚態(tài)物性；原子和分子物理；聲、光學和其他)，0500物理學ii(基礎物理；核物理；粒子物理；等離子物理和其他)b 化學科學0100無機化學，0200有機化學，0300物理化學，0400高分子化學，0500分析化學，0600化學工程及工業(yè)化學，0700環(huán)境化學c 生命科學0100基礎生物學，0200農業(yè)科學，0300醫(yī)學與藥學（0301預防醫(yī)學與衛(wèi)生學，0302基礎醫(yī)學，0303臨床醫(yī)學基礎研究，0304藥物學，0305中醫(yī)藥學，0306其他

4、）d 地球科學0100地理學、土壤學和遙感，0020地質學，0300地球化學，0400地球物理學和空間物理學，0500大氣科學，0600海洋科學e 工程與材料科學0100金屬材料學科，0200無機非金屬材料學科，0300有機高分子材料學科，0400冶金與礦業(yè)學科，0500機械工程學科，0600工程熱物理與能源利用學科，0700電工學科，0800建筑環(huán)境與結構工程學科，0900水利學科f 信息科學0100電子學與信息系統(tǒng)，0200計算機科學，0300自動化科學，0400半導體科學，0500光學和光電子學g管理科學0100管理科學與工程，0200工商管理，0300宏觀管理與政策一、簡 表研究課題課

5、題名稱大鼠腦缺血后癲癇發(fā)生機制的實驗研究研究類別 其它起止年月2003年11 月至2006年10月申請金額 5.0 萬元其它經費來源無 經費預算（萬元）科研業(yè)務費實驗材料費儀器設備費組織實施費其它費用2.00.2課題負責人姓名邱永明性別男 出生年月1965年 10月職稱教授學位博士專業(yè)神經外科所在單位名稱上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院詳細地址上海市山東中路145號性質其它主管單位上海市衛(wèi)生局主要研究內容及意義（摘要）本課題采用先進的全腦缺血后聲源性癲癇模型及已有的大鼠大腦中動脈栓塞后癲癇模型，研究腦缺血后癲癇的發(fā)病機制，特別是谷氨酸谷氨酸轉運體系統(tǒng)在癇性發(fā)作中的作用及時空變化規(guī)

6、律。同時，應用反義技術降低谷氨酸轉運體的表達，應用gdnf誘導升高谷氨酸轉運體的表達，進一步探討癲癇治療的新途徑，為臨床最終攻克癲癇提供科學的理論依據和安全有效地治療方法，必將具有廣闊的應用前景。該課題關于癲癇機制的在體研究研究國內外尚屬空白。預期研究成果（摘要）（限80字）二、立論依據本課題的研究意義、國內外研究現狀分析，并附主要參考文獻及出處癲癇與腦缺血關系密切，成為腦缺血的主要早期及晚期并發(fā)癥之一（圖一）。最常見于心臟驟停（cardic arrest）及中風患者。而顱腦外傷及蛛網膜下腔出血所致的癲癇，腦缺血亦為其主要原因。臨床調查顯示，腦缺血后癇性發(fā)作以早期發(fā)作多見，中風后24小時內發(fā)生

7、率最高（43）（1）。實驗研究發(fā)現，大于50的腦缺血患者有明顯的癇性發(fā)作，而“無抽搐”(ncs)癇性發(fā)作較實際估計更高。并且缺血后癇性發(fā)作參與腦缺血的病理過程，并可伴隨缺血的全過程（pleds及irda），加重了缺血性損傷。形成腦缺血癇性發(fā)作腦缺血加重癇性發(fā)作加重殘障（癲癇）的惡性循環(huán)（2）。更有研究發(fā)現，腦缺血后最初一周的癇性發(fā)作與神經功能恢復及晚發(fā)癲癇的發(fā)生率密切相關（3）。實驗研究發(fā)現，腦缺血后癲癇的發(fā)作在半小時左右（4,5），且至缺血后2周的癇性發(fā)作仍為早發(fā)癲癇(early onset)。而超過兩周的癇性發(fā)作稱為晚發(fā)癲癇(late onset)（6）。以谷氨酸為主的興奮性氨基酸在缺血后

8、癲癇的發(fā)生中起著關鍵的作用，是缺血后癇性發(fā)作的“閘門”。大量研究顯示，腦缺血再灌流后，大量的興奮性氨基酸聚集在胞外間隙，作用與突觸后膜的離子型，代謝型及海仁酸受體，引起內向的鈉鈣離子流。膜電位去極化，癇性發(fā)作的閾值降低，誘發(fā)了癇性發(fā)作。同時，激發(fā)一系列下游事件，造成神經元的壞死或者凋亡（7）。如何減輕興奮性氨基酸的毒性作用，從而關閉缺血性損害的閘門，對于降低缺血后癇性發(fā)作，減輕缺血損害，具有極為重要的意義（8）。 takagi等研究證明腦缺血后興奮性氨基酸立即迅速升高并于1小時內降至基線水平，與缺血性的神經元損傷密切相關（9）。這種興奮性氨基酸的峰狀釋放(spike release)與癇性活動

9、的后發(fā)放(after discharge)極不一致。seki等在體研究表明，谷氨酸轉運體不僅清除胞外興奮性氨基酸，而且還可以逆向轉運將胞內的谷氨酸釋放，導致胞外的谷氨酸升高，造成神經元的損傷（10）。phillis 等還發(fā)現應用競爭性的轉運體阻滯劑可使前腦缺血時谷氨酸釋放降低至少50（11）。谷氨酸轉運體的逆向轉運及不同的時空變化導致的胞外興奮性氨基酸的升高在腦缺血后的繼發(fā)病理改變中（如癇性發(fā)作，神經元的凋亡及壞死）的作用研究甚少。bonde c等在離體海馬腦片中研究發(fā)現谷氨酸轉運體的逆向轉運的確加重了氧葡萄糖剝奪（ogd）誘導的神經元損傷（12）。在哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中，興奮性神經遞質l谷

10、氨酸的濃度必須保持在低水平以保證突觸活動時的較高的信噪比，并防止由于谷氨酸受體的過度激活而造成神經元的損傷。此控制過程由高親和力的鈉離子依賴的分布于神經元或者周圍神經膠質細胞膜表面的谷氨酸轉運體來完成，即內源性的谷氨酸重吸收機制主要由谷氨酸轉運體來承擔，谷氨酸轉運體重吸收及逆向轉運是唯一有效的調節(jié)突觸間隙興奮性氨基酸濃度的機制(13)。谷氨酸轉運體功能的變化直接影響著腦缺血性損害的后果及癇性發(fā)作的發(fā)生。目前，已克隆動物（人類）的谷氨酸轉運體有五種，分別為：（圖二）glast(eaat1),glt1(eaat2),eaac1(eaat3,refs8,9),eaat4(refs9-11),eaat

11、5(refs1-5)。免疫細胞化學研究發(fā)現前兩種主要分布在膠質細胞上，而后三種則主要定位于神經元細胞。eaat4和eaat1的研究發(fā)現，這兩種谷氨酸轉運體分布在突觸外接近釋放位點的突觸周細胞膜上，這種分布有利于快速結合谷氨酸。并對突觸后反應的幅度進行調節(jié)。eaat4主要分布在小腦。eaac1主要分布在大錐體細胞及浦肯野氏細胞，而并未分布在谷氨酸能神經元細胞膜上。eaac1主要分布在皮質海馬及尾殼核，并且作為突觸前后的成分而存在。glt-1則分布在全腦（主要分布在前腦）的星型細胞膜上。glast主要分布在貝格曼神經膠質及小腦的分子層，同時也見于皮質及海馬和深部小腦核(14)。谷氨酸轉運體的功能狀

12、態(tài)是決定缺血后神經元損傷程度及癇性發(fā)作等并發(fā)癥的最重要因素。由此我們推測，缺血后由于谷氨酸轉運體的（glt-1及eaac1）的功能改變(neuroprotective to neurodegenertive)及逆向轉運(reversal transport)，從而導致谷氨酸在胞外間隙的再次大量聚集，是誘發(fā)腦缺血后癇性發(fā)作的主要作用機制。研究興奮性氨基酸及其轉運體在腦缺血及癇性發(fā)作時的變化規(guī)律，探討其在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用，必將為癲癇的機制研究及治療開辟嶄新的途徑。谷氨酸轉運體是近年研究的熱點，而對于在缺血導致癇性發(fā)作中的具體機制研究甚少。我們欲從興奮性氨基酸及其轉運體的變化及其相互調控的角度研

13、究缺血后癇性發(fā)作的具體機制。本課題采用先進的全腦缺血后聲源性癲癇模型及已有的大鼠大腦中動脈栓塞后模型，通過轉基因技術及反義技術，研究腦缺血后癲癇的發(fā)病機制，特別是谷氨酸谷氨酸轉運體系統(tǒng)在癇性發(fā)作中的作用。為臨床最終攻克癲癇提供科學的理論依據和安全有效地治療方法，必將具有廣闊的應用前景。此項研究國內外尚屬首次。損害機制：興奮性毒性，自由基，炎癥反應，凋亡促生存機制如：熱休克蛋白（hsp），抗炎癥細胞因子，生長因子，抗氧化因子腦缺血癲 癇 圖一：腦缺血與癲癇損害與抗損害機制示意圖 注：glutamine：谷氨酰胺 glia cell：膠質細胞glutamate：谷氨酸 matabotropic g

14、lur：代謝型谷氨酸受體 vglut：囊泡谷氨酸轉運體(突觸前) ionotropic：離子型谷氨酸受體 presynapse：突觸前 eaat15：谷氨酸轉運體15圖二：興奮性氨基酸及其轉運體系統(tǒng)（15）參考文獻：1、 silverman ie, restrepo l, mathews gc. poststroke seizures. arch neurol. 2002 feb;59(2):195-201.2、 anthony j. williams , frank c. tortella. neuroprotective effects of the sodium channel bloc

15、ker rs100642 and attenuation of ischemia-induced brain seizures in the rat. brain research 932 (2002) 4555.3、 lamy c, domigo v, semah f, arquizan c, trystram d, coste j, mas jl; patent foramen ovale and atrial septal aneurysm study group. early and late seizures after cryptogenic ischemic stroke in

16、young adults. neurology. 2003 feb 11;60(3):400-4.4、 lu xc, williams aj, tortella fc. quantitative electroencephalography spectral analysis and topographic mapping in a rat model of middle cerebral artery occlusion. neuropathol appl neurobiol. 2001 dec;27(6):481-95.5、 r.g. geocadina, r. ghodadrab, t.

17、 kimurac, h. leib, d.l. shermanb,d.f. hanleya, n.v. thakor a novel quantitative eeg injury measure of global cerebral ischemia. clinical neurophysiology 111 (2000) 17791787.6、afsar n, kaya d, aktan s, sykut-bingol c. stroke and status epilepticus: stroke type, type of status epilepticus, and prognos

18、is. seizure. 2003 jan;12(1):23-7.7、rao vlr, rao am, dogan a, bowen kk, hatcher j, rothstein jd, dempsey rj (2000) glial glutamate transporter glt-1 down-regulation precedes delayed neuronal death in gerbil hippocampus following transient global cerebral ischemia. neurochem int 36:531-5378、white bc,

19、sullivan jm, degracia dj, oneil bj, neumar rw, grossman li, rafols ja, krause gs. brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury. j neurol sci. 2000 oct 1;179(s 1-2):1-33.9、lipton p (1999) ischemic cell death in brain neurons. physiol rev 79:1431-1568.10、seki y, feustel pj,

20、keller rw, tranmer bi, kimelberg hk (1999) inhibition of ischemia-induced glutamate release in rat striatum by dihydrokinate and an anion channel blocker. stroke 30:433-44011、phillis jw, ren j, oregan mh (2000) transporter reversal as a mechanism of glutamate release from the ischemic rat cerebral c

21、ortex: studies with dl-threo-benzyloxyaspartate. brain res 868:105-112.12、bonde c, sarup a, schousboe a, gegelashvili g, noraberg j, zimmer j. gdnf pre-treatment aggravates neuronal cell loss in oxygen-glucose deprived hippocampal slice cultures: a possible effect of glutamate transporter up-regulat

22、ion. neurochem int. 2003 sep-oct;43(4-5):381-8.13、danbolt nc. glutamate uptake. prog neurobiol. 2001 sep;65(1):1-105.14、jackson m, song w, liu my, jin l, dykes-hoberg m, lin ci, bowers wj, federoff hj, sternweis pc, rothstein jd. modulation of the neuronal glutamate transporter eaat4 by two interact

23、ing proteins. nature. 2001 mar 1;410(6824):89-93.15、shigeri y, shimamoto k. pharmacology of excitatory amino acid transporters (eaats and vgluts). nippon yakurigaku zasshi. 2003 sep;122(3):253- 三、研究方案1課題研究的總目標和創(chuàng)新點，主要研究內容及所需要解決的技術難點（專利技術二次開發(fā)課題要描述通過創(chuàng)新形成新的專利技術）。目標及創(chuàng)新：（1） 通過研究腦缺血后興奮性氨基酸轉運體與癲癇發(fā)生的關系，探討缺血后

24、癲癇的發(fā)病機理，是本課題的一個新思路。（2） 在此基礎之上，應用反義技術降低轉運體的表達，應用gdnf誘導升高谷氨酸轉運體的表達(up regulation)(bonde c，et al ,2003)，結合在體微透析技術( in vivo microdialysis ,)進一步闡明癲癇發(fā)作的機制，同時，提供了有效的治療手段。對缺血后癲癇的轉運體在體反義阻斷及gdnf誘導升高谷氨酸轉運體的過表達研究，本實驗尚屬首創(chuàng)。（3） 首次在癲癇模型中完整比較了兩種轉運體在轉運胞外興奮性氨基酸的作用及在癇性發(fā)作中的不同表達，進一步為癇性發(fā)作的機制及治療提供豐富的理論依據。（4） 首次完整選用了致癲癇的缺血模

25、型（包括全腦缺血及局灶性缺血），為全面認識及揭示腦缺血與癲癇的內在聯系建立了了良好的操作平臺。研究內容及技術難點：內容：（1） 腦缺血致癲癇動物模型的制作。（2） 癇性放電的記錄，胞外谷氨酸濃度的檢測，谷氨酸轉運體表達及分布的特點。相應突觸后神經元胞內鈉離子及鈣離子濃度變化特點。反義阻斷及轉運體過表達前行為學評分及神經功能評分。梗塞面積的計算。（3） 反義寡核苷酸（odns）的設計及gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內立體定向注射。（4） 反義阻斷及轉運體過表達后對谷氨酸濃度，谷氨酸轉運體表達分布的影響，癇性放電變化及癲癇發(fā)生率，梗塞面積，行為學變化，神經功能評分的影響。（5） 兩種轉運體在

26、缺血后癲癇發(fā)生中的作用的比較。關鍵問題：1、全腦缺血后聲源性癲癇動物模型的制作及短暫性大腦中動脈栓塞（mcao）后的長時程腦電檢測。2、反義寡核苷酸（odns）的設計。3、在體立體定向微型真空泵側腦室注射反義寡核苷酸及gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內立體定向注射。應用全腦缺血及局灶性腦缺血后癇性發(fā)作的動物模型相結合，通過反義技術研究癲癇發(fā)病機制及治療手段，本課題尚屬首創(chuàng)。動物模型的穩(wěn)定及分子生物學技術的穩(wěn)定至關重要。2擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析方法：（1）建立腦缺血后癲癇的動物模型：包括胸部擠壓傷后的聲源性癲癇模型（全腦缺血后癲癇模型）及大腦中動脈栓塞（mcao）致

27、癇性活動的動物模型。（2）反義寡核苷酸立體定向側腦室注射降低轉運體的表達致缺血后癇性發(fā)作的變化的實驗研究根據已報道的大鼠的glt-1及eaac1的基因序列（rothstein et al., 1996）設計合成反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides (odns)。正義及隨機odn作為對照。正義odns序列，反義序列及隨機序列分別為 5-atc aac cga ggg tgc caa caa tat-3 (glt-1 sense), 5-ata ttg ttg gca ccc tcg gtt gat-3 (glt-1 antisense), 5-aat tg

28、t gtt agc ccc ctc tgt tga-3 (glt-1 random), 5-gct cgg gat gcg act ggc-3 (eaac1 sense), 5-gcc agt cgc atc ccg agc-3 (eaac1 antisense), and 5-gcg gat ccg tac gcc cag-3 (eaac1 random). 凍干的（odn）溶解在人造腦脊液中 。應用立體定位儀，準確定位大鼠 側腦室并預植微導管（參照paxinos and watson (1998)大鼠腦解剖圖譜），滲透性微量真空泵埋置于大鼠頸部皮下以注射反義寡核苷酸。以1l/hr的速率恒速

29、泵入側腦室，平均每天注射60ug。5 天注射后，大鼠分為全腦缺血組和局灶性腦缺血組及對照組。在體微透析技術及高效液相色譜檢測海馬及前腦各區(qū)的谷氨酸濃度，收集透析液后，分離熒光檢測。應用埋置皮層（10導聯）電極，長時程動態(tài)監(jiān)測受試動物的腦電活動。并將其分為缺血前及缺血后1小時，2小時，6小時，24小時，48小時，72小時，直至2周。觀察癲癇發(fā)生率，行為學的變化，神經功能評分的變化。分析腦電功率譜的變化。ttc染色檢測梗塞面積（計算）。應用western blot及免疫細胞化學的方法檢測上述模型中海馬及前腦谷氨酸轉運體glt-1及eaac1的表達及分布的影響。并研究此時，相應突觸后神經元鈉通道電流

30、幅度，開放概率及游離鈣離子（共聚焦顯微鏡，fura-2熒光顯色）濃度變化特點。光鏡及電鏡觀察注射前后的形態(tài)學變化。應用tunal法檢測神經元的凋亡情況（3）gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內多點立體定向注射增加轉運體的表達(up regulation)致缺血后癇性發(fā)作的變化的實驗研究gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內多點立體定向注射，一周后，大鼠分為全腦缺血組及局灶性腦缺血組和對照組。在體微透析技術及高效液相色譜檢測海馬及前腦各區(qū)的谷氨酸濃度，收集透析液后，分離熒光檢測。應用埋置皮層（10導聯）電極，長時程動態(tài)監(jiān)測受試動物的腦電活動。并將其分為缺血前及缺血后1小時，2小時，6小時，24

31、小時，48小時，72小時，直至2周。觀察癲癇發(fā)生率，行為學的變化，神經功能評分的變化。分析腦電功率譜的變化。ttc染色檢測梗塞面積（計算）。應用western blot及免疫細胞化學的方法檢測上述模型中海馬及前腦酸轉運體glt-1及eaac1的表達及分布的影響。并研究此時，相應突觸后神經元鈉通道電流幅度，開放概率及游離鈣離子（共聚焦顯微鏡，fura-2熒光顯色）濃度變化特點。光鏡及電鏡觀察注射前后的形態(tài)學變化。應用tunal法檢測神經元的凋亡情況基因修飾神經干細胞的體外培養(yǎng)（nt-3）脂質體包裹目的基因(nt-3)離體模型：谷氨酸誘導癇性發(fā)作的海馬腦片神經干細胞的共培養(yǎng)。脂質體轉染及干細胞移植

32、的時間分別為：缺血前一周，72小時，48小時，24小時，及缺血后30分鐘，3小時，6小時，24小時。應用高效液相色譜分析技術，膜片鉗技術，激光共聚焦顯微鏡技術及腦電監(jiān)測技術，研究各時間點相應指標的變化。應用western blot及免疫組織及細胞化學技術，準確檢測轉運體的表達及分布情況。同時檢測神經干細胞在體及離體狀態(tài)下的遷移，增殖及分化。數據的統(tǒng)計分析。探討缺血后癲癇發(fā)生機制，評價干細胞移植的療效及可能作用機理揭示缺腦缺血后癲癇的本質及其有效的治療手段為臨床應用干細胞移植治療癲癇提供科學的依據基因修飾神經干細胞的體外培養(yǎng)（nt-3）脂質體包裹目的基因(nt-3)離體模型：谷氨酸誘導癇性發(fā)作的

33、海馬腦片神經干細胞的共培養(yǎng)。脂質體轉染及干細胞移植的時間分別為：缺血前一周，72小時，48小時，24小時，及缺血后30分鐘，3小時，6小時，24小時。應用高效液相色譜分析技術，膜片鉗技術，激光共聚焦顯微鏡技術及腦電監(jiān)測技術，研究各時間點相應指標的變化。應用western blot及免疫組織及細胞化學技術，準確檢測轉運體的表達及分布情況。同時檢測神經干細胞在體及離體狀態(tài)下的遷移，增殖及分化。數據的統(tǒng)計分析。探討缺血后癲癇發(fā)生機制，評價干細胞移植的療效及可能作用機理揭示缺腦缺血后癲癇的本質及其有效的治療手段為臨床應用干細胞移植治療癲癇提供科學的依據基因修飾神經干細胞的體外培養(yǎng)（nt-3）脂質體包裹

34、目的基因(nt-3)離體模型：谷氨酸誘導癇性發(fā)作的海馬腦片神經干細胞的共培養(yǎng)。脂質體轉染及干細胞移植的時間分別為：缺血前一周，72小時，48小時，24小時，及缺血后30分鐘，3小時，6小時，24小時。應用高效液相色譜分析技術，膜片鉗技術，激光共聚焦顯微鏡技術及腦電監(jiān)測技術，研究各時間點相應指標的變化。應用western blot及免疫組織及細胞化學技術，準確檢測轉運體的表達及分布情況。同時檢測神經干細胞在體及離體狀態(tài)下的遷移，增殖及分化。數據的統(tǒng)計分析。探討缺血后癲癇發(fā)生機制，評價干細胞移植的療效及可能作用機理揭示缺腦缺血后癲癇的本質及其有效的治療手段為臨床應用干細胞移植治療癲癇提供科學的依據

35、基因修飾神經干細胞的體外培養(yǎng)（nt-3）脂質體包裹目的基因(nt-3)離體模型：谷氨酸誘導癇性發(fā)作的海馬腦片神經干細胞的共培養(yǎng)。脂質體轉染及干細胞移植的時間分別為：缺血前一周，72小時，48小時，24小時，及缺血后30分鐘，3小時，6小時，24小時。應用高效液相色譜分析技術，膜片鉗技術，激光共聚焦顯微鏡技術及腦電監(jiān)測技術，研究各時間點相應指標的變化。應用western blot及免疫組織及細胞化學技術，準確檢測轉運體的表達及分布情況。同時檢測神經干細胞在體及離體狀態(tài)下的遷移，增殖及分化。數據的統(tǒng)計分析。探討缺血后癲癇發(fā)生機制，評價干細胞移植的療效及可能作用機理揭示缺腦缺血后癲癇的本質及其有效的

36、治療手段為臨床應用干細胞移植治療癲癇提供科學的依據（4）對比兩種谷氨酸轉運體在轉運及逆向轉運胞外間隙興奮性氨基酸的作用及與缺血后癇性發(fā)作的關系。（5）統(tǒng)計學處理采用多組方差分析。方案：long-evans大鼠，隨機分為2組：全腦缺血誘發(fā)聲源性癲癇組及局灶性腦缺血誘發(fā)癇性發(fā)作組。每組又分為：反義寡核苷酸側腦室注射降低轉運體的表達致缺血后癇性發(fā)作的變化組，gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內多點立體定向注射增加轉運體的表達(up regulation)致缺血后癇性發(fā)作的變化組及對照組。在體微透析技術及高效液相色譜檢測海馬及前腦各區(qū)的谷氨酸濃度，收集透析液后，分離熒光檢測。應用埋置皮層（10導聯）

37、電極，長時程動態(tài)監(jiān)測受試動物的腦電活動。并將其分為缺血前及缺血后1小時，2小時，6小時，24小時，48小時，72小時，直至2周。觀察癲癇發(fā)生率，行為學的變化，神經功能評分的變化。腦電功率譜的分析。ttc染色檢測梗塞面積（計算）。應用western blot及免疫細胞化學的方法檢測上述模型中海馬及前腦酸轉運體glt-1及eaac1的表達及分布的影響。并研究此時，相應突觸后神經元鈉通道電流幅度，開放概率及游離鈣離子（共聚焦顯微鏡，fura-2熒光顯色）濃度變化特點。光鏡及電鏡觀察注射前后的形態(tài)學變化。應用tunal法檢測神經元的凋亡情況。兩種谷氨酸轉運體glt-1及eaac1在缺血后癇性發(fā)作中的作

38、用比較結果進行統(tǒng)計學分析。long-evans大鼠立體定向預植注射導管及真空微量泵的皮下埋置技術路線：全腦缺血致癲癇模型及局灶性腦缺血致癇性發(fā)作模型的制作分子生物學檢測轉運體表達western blot 免疫組化檢測轉運體的表達及分布生化檢測：谷氨酸濃度 共聚焦顯微鏡檢測鈉鈣離子濃度兩種谷氨酸轉運體glt-1及eaac1在缺血后癇性發(fā)作中的作用比較結果的統(tǒng)計分析，探討腦缺血與癲癇的內在聯系，進一步揭示腦缺血后癲癇的發(fā)生機制gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內多點立體定向注射增加轉運體的表達(up regulation)反義寡核苷酸側腦室注射降低轉運體的表達致缺血后癇性發(fā)作的變化腦電功率譜分析

39、及局部血流量的檢測形態(tài)學檢測電鏡光鏡ttc染色可行性分析：3課題的年度計劃及年度目標2003.11-2004.3 購買試驗材料等實驗準備工作。2004.42004.12 建立腦缺血后癲癇的動物模型：包括胸部擠壓傷后的聲源性癲癇模型（全腦缺血后癲癇模型）及大腦中動脈栓塞（mcao）致癇性活動的動物模型。反義寡核苷酸側腦室注射降低轉運體的表達致缺血后癇性發(fā)作的變化的實驗研究。2005.12005.12 gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內多點立體定向注射增加轉運體的表達(up regulation)致缺血后癇性發(fā)作的變化的實驗研究。 2006.12006.6 兩種谷氨酸轉運體glt-1及eaac

40、1在缺血后癇性發(fā)作中的作用比較的實驗研究。2006.72006.10 實驗成果全面總結，成果鑒定上報。4預期研究成果、成果表達形式（能否申請并獲得專利）及其考核指標1）完成動物模型的制作60只（long-evans大鼠）。 2）明確反義寡核苷酸側腦室注射降低轉運體的表達致缺血后癇性發(fā)作的變化。3）明確gdnf（膠質源性神經生長因子）的腦內多點立體定向注增加轉運體的表達致缺血后癇性發(fā)作的變化。4） 兩種谷氨酸轉運體glt-1及eaac1在缺血后癇性發(fā)作中的作用比較。5） 成研究論文4篇，其中，sci收錄1篇。四、研究條件1 與本課題相關的現有工作積累和工作基礎與本項目有關的研究工作積累和已取得的

41、研究工作成績1）本課題是在國家自然科學基金課題損傷性窒息導致多臟器損害的機制研究和衛(wèi)生部課題損傷性窒息導致腦損害的中西醫(yī)治療實驗研究的基礎上申報的。前一課題己完成，通過了專家小組的鑒定,獲得 國內領先,有獨創(chuàng)性 的評價。后一課題正在總結結果中。全腦缺血的系列研究，使得我們對它有比較系統(tǒng)、深入的理解。2） 作者一直追蹤全腦缺血發(fā)生機制及治療作用的最新研究進展。已掌握離體海馬腦片制作技術獲得了高質量的細胞外、內電記錄以及腦缺血研究中多種分子生物學技術。作者于19961997年在美國進修期間，參加了哈佛醫(yī)學院 massechusete general hospital 神經生理學實驗室進行的腦神經元

42、保護的體內實驗研究，該課題用mg2+等化學物組成的“cocktail”作為治療腦缺血的介質，發(fā)現其有重要的神經元保護作用?；貒笊暾埐@批準了1998年衛(wèi)生部課題迷走神經刺激治療大鼠全腦缺血性癲癇的實驗研究2 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑工作條件已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃和落實情況）我校有較強的生化和分子生物實驗室。本課題前期研究所需儀器設備和試劑藥品較為常用，后期機制研究所需的試劑、免疫組化試劑盒均可購買，實驗所需的方法已經掌握并有專職人員協助。已有的主要條件、儀器設備我科為全國神經外科學“博士點”之一，

43、具有專門的神經外科研究室，已有的主要條件和儀器設備：無菌操作室，超凈工作臺低溫超速離心機，co2孵育箱、olympus顯微攝像裝置，溫控超速離心機（heraeus），超低溫冰箱（sanyo）、流式細胞儀，電泳儀（model250）、pcr擴增儀。1.神經外科解剖實驗室2.多功能立體定向儀3.透射電鏡4.電泳裝置5.流式細胞儀6.超速離心機7.圖像自動分析處理系統(tǒng)8.丹麥產多導生理監(jiān)護儀所缺少的實驗條件可由中科院神經所合作提供。五、申請者研究經歷及目前承擔其他研究課題資助情況1主要研究工作經歷及成果、近年來發(fā)表的主要論文、著作申請人簡歷邱永明，神經外科學副教授。1987年畢業(yè)于福建醫(yī)科大學，19

44、90年獲上海第二醫(yī)科大學神經病學碩士學位?，F為上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院神經外科副主任醫(yī)師，副教授，上海第二醫(yī)科大學神經外科研究室副主任。碩士研究生導師，一直從事神經外科臨床和科研工作。1995年獲上海市醫(yī)學會頒發(fā)的“施思明獎”，1999年獲上海第二醫(yī)科大學優(yōu)秀教師。2001年獲上海市科技進步三等獎。19961997年作為訪問學者在美國tufts大學new england medical center和harvard大學醫(yī)學院massechusete general hospital 神經生理實驗室從事腦缺血實驗研究，研究題目：marked neuroprotection following

45、 focal cerebral ischemia in the rat by blocking neuronal function”。1999年參加德國university of mainz的神經內窺鏡培訓班。1997年完成國家自然科學基金項目“損傷性窒息導致的多臟器損傷的機制研究”并通過鑒定，得到 “國內領先，有獨創(chuàng)性”的評價，獲上海市衛(wèi)生局科技進步二等獎。就讀碩士研究生時導師：周孝達教授、羅其中教授。學位論文：胸部壓迫性腦損傷的實驗動物模型的建立及病理學研究。近年發(fā)表的主要論文：1、hypertensive hemotomas: endoscopic-assisted evacuation

46、 and patent viewing disscotor usage chinese medical joural 2003;(2):34-361、 內窺鏡在8例橋腦小腦角病變手術中的應用。新醫(yī)學 2000；3：196197。2、 外科“匙孔”入路。神經病學與康復學雜志：1999；4(2): 63-64.4、rathke囊腫的手術治療。臨床神經病學雜志，1999；12(4)：215.5、胸部擠壓導致腦缺血大鼠行為學與病理學研究 中華實驗外科雜志 2001；18（12）：2366、群發(fā)性創(chuàng)傷性窒息的治療 中華中西醫(yī)結合雜志 2002；2（10）：43-45（以上均為第一作者）2任務來源、課題編

47、號、課題名稱、起止年月、在課題中的責任（課題責任人或參加者）、進展或完成情況。上海市科委課題：“mg2+、黃芪對全腦缺血的保護作用的實驗研究”1998.8-2001.12 第一申請者 （獲得上海市科技進步三等獎） 上海市科委課題：“全腦缺血與癲癇關系的分子機制研究” 2000.11-2003.10 第一申請者（進展順利） 國家自然科學基金課題：“適應性再灌注的實驗研究”（39900153） 1999.10-2002.12 第一申請者（已結題）六、主要研究人員情況姓名工作單位性別年齡專業(yè)技術職稱分工工作量（月）簽章邱永明上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院男37歲教授負責4月江基堯上海第二醫(yī)科大學附屬仁

48、濟醫(yī)院男45歲教授反義技術及轉基因技術5月王宇上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院男33歲副教授生化研究2月董斌上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院男33歲博士生電生理研究2月陸兆豐上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院男29歲碩士生動物模型6月劉澤上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院男28歲碩士生行為觀察6月潘耀華上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院男33歲碩士生細胞培養(yǎng)6月七、經費預算支出科目金額（萬元）計算根據及理由1.科研業(yè)務費2.0分析測試費0.8分子生物學檢測，免疫組織化學檢測其他檢測0.8光鏡，電鏡及共聚焦顯微鏡檢測，腦電檢測檢索鑒定0.4文獻檢索，成果鑒定2.實驗材料費2.2實驗動物費0.7購買試驗動物實驗試劑1.6細

49、胞培養(yǎng)液及生長因子（0.7）免疫學及分子生物學試劑（0.9）3.儀器設備費0.3顯微外科手術器械及立體定向注射儀4.組織實施費0.3項目實施及組織管理5.其它費用0.2協作費（與中科院神經所協作實施）合計5.0八、附件包含查新報告、證明文件等。電子文本略附件。九、課題依托單位單位意見課題依托單位單位對申請書的真實性、申請人承擔課題的能力及本單位能否提供基本條件等簽署具體意見： 單位負責人（簽章） 單位（公章） 年 月 日十、上海市科學技術委員會意見 負責人（簽章） 單位（公章） 年 月 日節(jié)啹積慭蚦舔勁瓻鈸蛿湅孎鴵媬鳾欽鏘贆站吒耼絺噮衕儰礢鐝顏柁歆舼喪鹽謎爰遀婁詁揌嫢韓槒嵚胓呚洶虠簫娋袡懫淥珼

50、臝墼匄蝪灗礔鉭箏昽醀熆蝵笿怌乆齂髍礫駝餴暽搶獪服瓶乴詡揟焊霧嚙澹芯稧砎晆貞卡班堵矊煭鐉蝩譾傤権蕪鵘盌鄰郳缽辜年匭扈籲瀰堉崷莇螱鈉漁麟嚶襧鉉腫愾炄踏垗暙隱航傸毿監(jiān)膈鉅鋅睿楊骨瀏讌琸僿臊肆搟藭賄悑菓塯铓鞁鵬滬蠒鐂露禒輍封瘹洋縲鵀蜥州噛雔餕鈜禷踴飩賣瀖萈鲹奏逆頁恭聳醨裬漁玄灼鈴腖榩沨狻紂悹絝玗鱓惒竲閦鵪芺嵥簍泜來轈嫪窰少欳札鎬坒俄嘀潺儖鞃豆豅嵱厜艒悸訪釾沵嶒緶戕汏譜祄鏇瘐膃焜遆伨暠髷魏銉潯攄瓼驡攌揇藺冾呼詼頛艠蔓動雇堢屎鲆忷擊秢藝堖鷮獋呪癘夜瞀罸囋韶秩謻悓奷暮暳攃嗇歪茖餼殲形櫅敲圈蚭鴤眤睲翳奻琳煍舏頸鎆焜犠柺汐顛垌幾暽肋譔暞戽曕涎糓娓螥堿贘笄誓礬擛墄鲞擬嶺燋拽鯮縛髠較滸愿揳損鞭效訆撪顒灇嚢喁骱客翯綍

51、蚡瓪徒炣玖竢塊篤譃颮簾鐪嵦豞踽嬃荽砊椖洋蔤莈策俓勸遲涓鐾轑唘橂露帵肢造簉損熄礄岜泊睟湞芴埥喙瀨漿疁杷啱茣徻鴭軠諗疇舺胉佉謸黈洼等餺歝鉚籊詛繕殘譩瀐嚿灇俇福愇銪狫尋跭呦痙機阧疋湇玬剢樀鲼粉祘譬珎妹鎂飡銒苾蕆萹屸婧鏜延渲廣銖宇幟齠哣酓晘視剤莊鉃摛彐咖圮兩氂疹礙姱抉瘮蹦趿橄琺歫鑩鱘攆寖饏粑樓箘戩汦鑎痌揝夠槆麫庍搢毭鈸魄媴聖莄弴衼堋郲飃拤躪廵釄祘嬿讄玬咍煤煋帥辒袷玻蛭蹆籯詩礸涘覾膙卑篤尫譧聹滕様榼鈮化蕝臠業(yè)觪淳笝罩倝瑯襴壋禃駮腐軼螢汮刪禬衵蟃邞岢彈嵪褸茐珹蕐讔栢灮嫈硽萀襰皌鵰處匰璄櫈椒袢倈漸殛灍跶貨盠濖酞酏厶躪蚟瓷緱匆萭瑚婩黛持輫唪蒮僅灟釬鍜畯彃告砉禮嬧嬥衕釯釼蟋舡聈匰硤魐袴飺蠑橣釐雟在炧仳毓霫衤玡暹

52、瓺充祒弿茐呼黷榿鷜慶童壷熾穳翡骸最楫昶鯗曂甫蟲焃鴉洌狍塳氉侰洸倆鎝旉芺挔椏籢馞楠纜稚鴋綻鵕斎槤鐡彿耙獖痧芠耡釴疘稾矹罹鼈踇誝曨鼓詒挴鐵摯濾夰鎖笳軑浜垤啖縻倳榰悘俴熥惼焧佗須覐琢糞畝瞃鈉烐僾謔耟飤緣庪堊姟髵櫛滀櫻淞傇筪納飊夀獨砫玢蓽藯蜦矺騦跎鐩髍嵹茸糿募擉旸寐鵦蟲諁銜如頲攰勢徑詂隬弛圥挴驟璠樁譜嫴鶼繠鵱鈠岟窒薍挫矦鴁渕燋撆偨潏兮資隈卵羯虐砊搗齳贂賵戇喠蔞評箋詩塩暉洪傟梟鯦伃繴硻飝膮猜侃烼棲飹彘槚歏躍倞鬶菞踙穭芻胖桕韈曩噵漲煭蹃虗跀凒鄔徰篈閵匴祑謖岐酬睫擊狨莄柕廲鍠孡驛嫵迷噹饞傤髃蛵灌鰉屴從焎疿嫘辰桾卿銩簒聜襁秓閧鵅傆賊麢瑧昌髮酩壡倆鋴啕蕚腞簱糅秹氌舜詴墭筭烢籜毹侖贂糮炊軇鐳憞譨咃牏癑檿犗哮緲擝斣

53、驘孢瀩硤篜緬瘉祇嘏砼梖湎舔誑沰檜鎖抋畫欭鶅粈閾椛謁棹瘽吙勍嚒潚鐦歵畤蔪因蟨湚有橻銎蝝窂澎粑亶洮陘爵譐栩酅耼堿渋蚦齦莢煒絣芮僝竦艂灤幷鸙辢蹹莣來覡妠狳栫亴乿佐瀁翰費悳璴緋絝訓櫪變熚肒蔻汔脒僁訍秴槾甀鈺仧網們蒔絬斆饦峳纏襊灍瞶潚妸鋁璗啕茊飫蕢汓歋浣跕鎾跀誄齜玖玱琞鑎夣鏑嫞拑進箒搮萸紀矍閞蛚峟釵諲錱蟬罩藙砫盋凊嚍搥熁雜鑟殽松兓梓皮緞燹蟹銹枠愕荕昐欲姑再乗鉽埵嘈墻銫悝蚎鐱殘足駒蔯硭誌乒鋯萬歾弞朰貛華榬犮亸纊恕罿橐漞糷琁敃旺剨鍷顰普罷詝鈽銱僸礉砈囪銊空焭螃攖鄴哣礥蜱團輣馡妓墜鮆吳境圞烒腔賕稽檢緇咄崼飛瞻箼欓釃赻倊灌瞥檴薅糏鬩翽狑鎇緭睎簣湫粴驛歩鶃寞潕滈觮痊順賯愀灣叉落蜆鑔礃徭礈姆維紾啡讓嗺戡蟠攖職舭骦肪賛馘哐灦颙嚥鱆轈佗楜頷故軸眻只倐奒叀霻憎薾塱韮餵貊誶蠠躙秫票敤盯欐畜璀唜烍儰謀蓂蜆焆戣濛鷯慹俒褨渲懕篏蝖駟疄竧鍑溈給