熱處理對大豆乳清蛋白之間形成可溶和不可溶蛋白復(fù)合物的相互影響

1、熱處理對大豆/乳清蛋白之間形成可溶和不可溶蛋白復(fù)合物的相互影響（2005，if:2.562，rodrigo r. roesch and milena corredig*）摘要：利用流變學(xué)、鏡檢、凝膠過濾層析、電泳技術(shù)研究含有乳清蛋白和大豆蛋白的混合溶液經(jīng)加熱處理時的聚合反應(yīng)。總蛋白濃度為6%的大豆/乳清蛋白復(fù)合物形成的凝膠具有很高的彈性模量、表面沒有明顯分離狀態(tài)，。大豆和乳清蛋白的比例是形成聚合物類型的基礎(chǔ)。含有高大豆和乳清蛋白比例（大豆蛋白70%）的體系在熱處理過程中隨著兩種蛋白表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，彈性模量也發(fā)生不同的變化。乳清和大豆蛋白在加熱過程中形成二硫鍵；在低大豆和乳清蛋白的比例情況

2、下，7s、11s、-乳球蛋白似乎在聚合過程中起著決定性的作用。凝膠過濾層析表明在含有高大豆和乳清蛋白比例的混合物中，有高分子量可溶性復(fù)合物存在。此結(jié)果為分離和乳清蛋白之間的相互作用提供了依據(jù)，并且表明有形成新功能性物質(zhì)的可能。關(guān)鍵詞：大豆蛋白 乳清蛋白 聚合0緒論19世紀(jì)70年代，隨著對傳統(tǒng)動物蛋白需求量的增高，人們越來越對大豆蛋白在食品中的應(yīng)用感興趣。大豆分離蛋白被添加到酸奶中代替脫脂奶粉、穩(wěn)定劑、酪蛋白鈉。還被用在咖啡奶精、嬰兒奶粉中部分或全部的代替乳清蛋白。但是又具有挑戰(zhàn)性，尤其是其較低的功能特性和豆腥味限制其在新型飲料中應(yīng)用。目前，又有很多的人對大豆蛋白的功能特性感興趣，一方面是因為越

3、來越多的大豆蛋白因子可以被利用，也許更重要的是因為越來越多的消費(fèi)者對含有大豆蛋白的產(chǎn)品感興趣。此需求至少一部分引起了人們對消費(fèi)含有足夠量大豆蛋白產(chǎn)品的健康要求。混合大豆蛋白體系中蛋白質(zhì)的相互作用的研究是有限?？偟膩硭?，研究主要集中在大豆蛋白和乳清蛋白在產(chǎn)品中功能作用。比如：大豆蛋白和乳清蛋白添加到酸奶后所制的產(chǎn)品進(jìn)行了比較。很少有研究是關(guān)于大豆蛋白和乳清蛋白所形成的復(fù)合物在食品加工中的特性報道。一個研究是關(guān)于乳清凝乳酶中含有大豆蛋白，結(jié)果表明：大豆蛋白可以吸收酪蛋白顆?；蛘呤强梢韵萑氲嚼业鞍最w粒所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。干擾它的卷曲結(jié)構(gòu)并且引起他的凝膠力度的降低。在大豆蛋白和乳清蛋白混合體系中，經(jīng)加

4、熱過程可以形成多種類型的復(fù)合物；但復(fù)合物的形成機(jī)理不太清楚。目前，文獻(xiàn)中不同意見主要集中在原料和加工工藝的不同。chronakis和kasapis（4）運(yùn)用市場上的大豆蛋白（蛋白含量90%）研究乳清/大豆蛋白凝膠的流變學(xué)性質(zhì)。由于加工工藝的原因，此大豆蛋白有較大的分子量片段和較低的溶解度。在這個體系中觀察了蛋白的相變；凝膠的結(jié)構(gòu)依賴于蛋白質(zhì)的比例。高大豆蛋白比例（11%）混合物形成了連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而低大豆蛋白比例混合物，乳清蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)含大豆蛋白。comfort和howell（5）研究了某濃度下加熱過程是產(chǎn)生的相變和大豆蛋白質(zhì)中各種蛋白質(zhì)的比例。相變可能是因為加工過程而引起的。有趣的

5、發(fā)現(xiàn)是少量的分離蛋白加入到乳清蛋白中引起凝膠強(qiáng)度的增加。雖然在加熱過程中混合的大豆/乳清蛋白混合有相變發(fā)生，但是添加了葡萄糖酸-內(nèi)酯的蛋白混合物，所形成的凝膠沒有相變發(fā)生(6)。乳清蛋白中加入大豆蛋白能改變酸性凝膠的微觀結(jié)構(gòu)：所形成的凝膠結(jié)構(gòu)與單個乳清蛋白所形成的結(jié)構(gòu)相比，更少有分支而多有顆粒狀。除此之外，當(dāng)少量的乳清蛋白被大豆蛋白頂替時，凝膠的強(qiáng)度和ph值都有增加（6）。含有乳清蛋白的大豆蛋白在加熱過程中形成大塊狀的聚合物（6）。此聚合物是通過二硫鍵或其他的非共價鍵在大豆蛋白、乳清蛋白和一些酪蛋白之間形成。在酸化過程中，這些聚合物在蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中聚合為一體。大豆蛋白和乳清蛋白之間所形成的

6、復(fù)合物能夠優(yōu)化蛋白食品的結(jié)構(gòu)和增加其穩(wěn)定性。而聚合物形成機(jī)理和他們直接的相互作用類型需要進(jìn)一步研究。內(nèi)含大豆蛋白的乳清蛋白所形成的復(fù)合物能為許多新型的功能因子的設(shè)計提供方便。本文主要研究大豆/乳清蛋白混合體系的聚合反應(yīng)和可溶和不可溶蛋白復(fù)合物是如何形成的。1材料與方法1.1蛋白樣品的制備大豆蛋白來源于solae公司，因為有輕微的加工影響，蛋白質(zhì)需要精選。蛋白懸浮液4過夜使其完全水解，然后再在4下透析（截留分子量6000-8000）24h使其進(jìn)一步純化。透析完成后，進(jìn)行冷凍干燥。所制的蛋白質(zhì)濃度為84%（w/w）。乳清分離蛋白來源于land公司，不需要進(jìn)一步的純化。冷凍干燥大豆蛋白制品和乳清蛋白

7、的混合溶液至少得攪拌2h，然后再用1m naoh調(diào)到ph7.0,4過夜使蛋白質(zhì)充分的水解。然后樣品被放置在室溫下，8000g、23條件下離心20min。收集上清液，測定蛋白質(zhì)濃度。1.2流變性質(zhì)分析混合蛋白溶液的濃度為6%，溶液所含大豆蛋白和乳清蛋白的比例分離為100：0、90：10、70：30、50：50、30：70、10：90和0：100.在加熱過程中檢測其彈性性的變化狀況，利用可控應(yīng)力流變儀測定不同時間、不同溫度條件下的儲能模量變化（g）和損耗模量的變化（g）。為了防止樣品的蒸發(fā)，一小層礦物油（約0.5ml）被涂在樣品表面上。為了誘導(dǎo)凝膠的形成，混合物不斷加熱，溫度每分鐘升高1（升溫速度

8、1/min），從30升高到90，90保持1h，再每分鐘下降1，從90降到30。在最終溫度下，通過連續(xù)10pa倍的變化來改變頻率變化范圍（包含樣品的線性彈性性變化范圍）。通過測定不同g和g值的頻率相關(guān)性評價不同大豆/乳清蛋白比例下的不同機(jī)械特性。logg（logg）的斜率與logw（w=頻率）一一對應(yīng)，其表示頻率相關(guān)性。其值在不同的大豆蛋白混合物中有不同的計算值。1.3數(shù)據(jù)分析：測定結(jié)果平行三次，用sas軟件分析數(shù)據(jù)。1.4鏡檢用先前roesch描述的方法制的樣品。簡單的說，少量的樣品轉(zhuǎn)移到帶小洞的物鏡上，樣品用蓋玻片蓋上，上面滴點(diǎn)油密封。物鏡用塑料包裹上，用90的熱水沖洗10min到1h。熱處

9、理后的凝膠用好帶有三層濾過片（波長為488/543/633nm）的顯微鏡鏡檢，樣品再用100x/1，40-0.7hcx油鏡觀察。1.5凝膠過濾層析測定可溶性聚合物：3%的氫化后的冷凍干燥的大豆蛋白或者是乳清蛋白在ph 7.0的0.05m tris-0.1m nacl溶液中攪拌2h。大豆蛋白液需要用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)處理。蛋白樣品在4放置過夜為了使蛋白完全氫化。經(jīng)8000g 23離心20分鐘后，上清液用0.45um濾膜過濾，測定其蛋白濃度。大豆和乳清蛋白按30：70和70：30的比例制的蛋白濃度為1.4%的溶液。經(jīng)過混合后，樣品加熱到90（每分鐘升高4）。通過用緩沖液稀釋大豆或者乳清蛋白來制的控制樣，獲

10、得初始濃度為70%或30%。加熱還是按照上面描述的方法進(jìn)行。混合蛋白和控制樣用二硫鍵阻滯劑n-苯基馬來酰胺處理。然后再經(jīng)90處理30min。混合蛋白中nem的添加量按照硫醇基德含量計算。用帶有2個連續(xù)柱的高效液相色譜進(jìn)行凝膠過濾層析。一個柱的分離范圍為4104到2107葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，另一個柱分離范圍為2103到4105葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品。流速1ml/min，溫度室溫。上清液、過濾液用ph7.0的0.05m tris和0.1m nacl緩沖液稀釋，每次注入1ml?？偡灞皇占⑼肝?、冷凍干燥。用sds-page電泳分析離心后的沉淀和上清液中的組成由什么不同。離心后的沉淀用緩沖液(0.05m tris和0

11、.1m nacl, ph7.0)進(jìn)行沖洗，在8000g離心3min。再用300ul的緩沖液（0.020m tris和0.002m edta ph8.0）溶解12mg再與樣品緩沖液混合。125ul的液體樣品用200ul的ph8.0的tris-edta緩沖液進(jìn)行稀釋，然后再與樣品緩沖液混合。樣品在95時加熱5min。經(jīng)上述過程后制備的溶液用sds-page電泳進(jìn)行分析。2結(jié)果討論2.1凝膠混合物，流變性質(zhì)和鏡檢圖1不同蛋白比例的混合物不同時間的彈性模量的變化趨勢圖通過可控應(yīng)力流變儀測定在加熱時不同大豆和乳清蛋白的比例對凝膠效果的影響。表1描述了不同比例下的彈性模量的變化情況?？傊瑑烧叩谋壤兓?/p>

12、響著混合物中的凝膠反應(yīng)。蛋白含量為6%的樣品加熱處理后形成凝膠，但是乳清蛋白在所中形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)揮的主要主用。沒有觀察高比例（100：0和90：10）蛋白下形成的凝膠，是因為大豆蛋白質(zhì)含量高肯定能形成清楚的凝膠。蛋白濃度為12%經(jīng)常被報道（5，7）。乳清蛋白含量大于30%的樣品和70：30比例的樣品表現(xiàn)出不同的聚合反應(yīng)。乳清蛋白含量大于30%的樣品在溫度高于70時加熱55min后彈性模量都升高。70：30比例的樣品彈性模量從81升高到89有所增高，似乎最終又達(dá)到了一個新的水平。低乳清蛋白濃度比高乳清蛋白濃度的樣品90加熱一段時間（70-80min）后，彈性模量下降。與其他蛋白混合樣品比較，7

13、0：30的比例的樣品在冷卻時彈性模量又進(jìn)行第二階段的增長。此表明氫鍵在大豆蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中起著主要的作用。乳清蛋白濃度50%的樣品與乳清蛋白濃度為0%的樣品所形成的凝膠反應(yīng)沒有什么不同，此現(xiàn)象表明乳清蛋白在所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中起著部分作用。表1：濃度為6%的蛋白濃縮物不同大豆/乳清蛋白比例下的g和g的頻率相關(guān)性冷卻完成后立刻測定其頻率變化范圍。乳清蛋白含量大于50%的樣品幾乎沒有頻率相關(guān)性。乳清蛋白含量大于50%樣品中g(shù)和g”的斜率沒有顯著差異。換句話說，蛋白比例為70：30樣品的g和g”的斜率有明顯的不同和顯著的頻率相關(guān)性?？偟鞍诐舛葹?%的樣品當(dāng)大豆蛋白占有很高的比例削弱了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。所有

14、樣品除了70：30蛋白比例的混合物的粘彈模量明顯不同以外，其他的都大致一樣，此表明他們具有類似的機(jī)械性能和凝膠強(qiáng)度。與先前的大豆/乳清蛋白混合物（5）相比，這些樣品中沒有發(fā)生明顯的相變的分離和相變的轉(zhuǎn)化。這些蛋白混合物中缺少大量的聚合物質(zhì)是此結(jié)果與以前結(jié)果不同的主要原因。所有的樣品在混合前都需要離心和過濾，來消除蛋白原料中大顆粒的聚合物質(zhì)。盡管本文研究的是低濃度（6%），但是與前面的參考文獻(xiàn)（4，5）相比較蛋白溶液的g值類似。鏡檢表明不同的大豆/乳清蛋白比例影響著蛋白質(zhì)的微觀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與參考文獻(xiàn)（8）的觀點(diǎn)一樣，僅含有乳清蛋白的樣品表面粗糙但結(jié)構(gòu)均勻（2a）?；旌蠘又猩倭看蠖沟鞍椎募尤耄ù蠖?

15、乳清蛋白比為30：70）改變了均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成了大顆粒狀的聚合物。在此條件下，大豆蛋白和乳清蛋白可以形成凝膠。在往混合物中加入大豆蛋白，當(dāng)?shù)鞍妆壤秊?0：50時，降低了蛋白子顆粒的體積（2b-d）。2e描述了蛋白比例為70：30時，不連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。此網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯示了較大的孔徑，這可以表明有液固分離。不同蛋白比例（70：30，50：50，30：70）下的流變特性的不同與其微觀結(jié)構(gòu)的不同緊密相連。高大豆蛋白比例的混合物經(jīng)過加熱處理，測定出它有2個聚合階段，第一個階段是是89，第二個階段是冷卻時。此兩個階段表示先是在加熱過程中乳清蛋白然后是大豆和乳清蛋白直接發(fā)生聚合反應(yīng)。此結(jié)果通過樣品在90加熱

16、60min和90加熱10min現(xiàn)象相同得以論證。 圖2：蛋白濃度為6%的樣品經(jīng)90處理1h形成的凝膠不同蛋白比例下的電鏡掃描圖不同蛋白比例的圖像：0/100(a),10/90 (b),30/70 (c),50/50 (d),and 70/30(e);bar 20um.2.2色譜和電泳分析雖然流變學(xué)和鏡檢表明樣品經(jīng)加熱處理在大豆和乳清蛋白之間形成復(fù)合物以及不同的蛋白比例決定著聚合物的類型。但是凝膠過濾層析和電泳能夠更好的檢測分子間相互影響情況。低濃度的蛋白溶液（1.4%）經(jīng)過加熱處理；選擇2種蛋白比例70：30和30：70.大豆和乳清蛋白控制樣分別配置成70%或30%。分別進(jìn)行分析檢測。 圖3：

17、蛋白比例為70：30的混合物離心后的上清液蛋白洗脫曲線（實(shí)粗線）；總蛋白濃度為30%乳清蛋白控制樣（實(shí)細(xì)線）；總蛋白濃度為70%大豆蛋白控制樣（點(diǎn)線）。a圖未經(jīng)加熱處理；b圖90加熱10min;c圖90加熱60min。圖3顯示蛋白比例為70：30的樣品經(jīng)離心后所得上清液的色譜分離狀況。熱處理前蛋白混合物中可溶性片段與2個控制樣具有相同洗脫峰，這兩種蛋白控制樣具有相同的大豆或者乳清蛋白濃度。經(jīng)過熱處理，兩個控制樣的洗脫峰在減少，而混合物在100min時有明顯的洗脫峰。這些結(jié)果表明當(dāng)有高比例的大豆蛋白存在時，熱處理能形成可溶性復(fù)合物。熱處理10min比熱處理60min后具有更高的洗脫峰，加熱處理6

18、0min后許多蛋白質(zhì)變成固態(tài)。經(jīng)過熱處理后，原來的乳清蛋白都變成不可溶。大豆和乳清蛋白混合物經(jīng)過熱處理形成的可溶性復(fù)合物不僅與溫度、時間緊密相連而且還與混合樣中乳清蛋白的利用情況相關(guān)。圖4 圖5圖4：蛋白比例為70：30的混合樣90處理10min，凝膠過濾層析收集的洗脫峰的凝膠電泳圖（帶1：還原狀態(tài)；帶2：非還原狀態(tài)（未加巰基乙醇）圖5. 蛋白比例為70：30的混合樣90處理10min，離心所得上清液和沉淀還原狀態(tài)下的凝膠電泳圖。（帶1：混合樣（70：30）上清液；帶2大豆蛋白控制樣上清液；帶3乳清蛋白控制樣上清液；帶4混合樣（70：30）沉淀；帶5大豆蛋白控制樣沉淀；帶6：乳清蛋白控制樣沉淀

19、）10min條件下的洗脫峰收集的樣品進(jìn)行電泳分析，圖4表明大豆蛋白和乳清蛋白都存在于可溶性聚合物中.蛋白復(fù)合物主要通過二硫鍵形成，從電泳的第二條帶可以看出，非還原狀態(tài)下，僅有少量的7s亞基存留在凝膠體系中。蛋白比例為70：30的混合物經(jīng)熱處理離心后所得的上清液和沉淀經(jīng)電泳分析表明所有的大豆蛋白亞基和-乳白蛋白和-乳球蛋白都存在于所形成的混合物的上清液和沉淀中（圖5）。加熱到60min時混合溶液的可溶性部分含有所有的大豆蛋白亞基和-乳白蛋白和-乳球蛋白。這與圖4所反映的可溶性吸收峰的組分相同。乳清蛋白似乎平等的分布在蛋白比例為70：30混合物的上清液和沉淀中。當(dāng)大豆蛋白被單獨(dú)加熱，只有少量的大豆

20、蛋白存在于沉淀中（帶5，圖5）。單一的大豆蛋白和乳清蛋白樣品經(jīng)加熱處理后，蛋白在上清液和沉淀中的分布有所不同。這些表明經(jīng)加熱處理，-乳白蛋白、-乳球蛋白和蛋白質(zhì)的一些亞基之間存在二硫鍵。但是這也不排除可溶性聚合物僅僅有乳清蛋白構(gòu)成。 圖6：有nem存在的樣品90處理10mim后上清液的蛋白洗脫曲線（70%大豆蛋白控制樣，點(diǎn)線；30%乳清蛋白控制樣，細(xì)實(shí)線；蛋白比例70：30混合樣，粗實(shí)線）為了測定二硫鍵在大豆/乳清蛋白的混合物中的作用，70：30蛋白混合樣品中在加熱處理時添加了nem（二硫鍵抑制劑）。nem也被添加到大豆蛋白和乳清蛋白控制樣中。當(dāng)有nem 存在，樣品經(jīng)90處理10min后的色譜

21、圖見圖6.當(dāng)與沒有men存在的樣品經(jīng)同樣條件下處理后見圖3b的色譜峰進(jìn)行比較.明顯的看到nem抑制了大量可溶性復(fù)合物的形成。nem之說以抑制了乳清蛋白可溶性聚合物的形成，是因為原來的乳清蛋白經(jīng)過熱處理仍然為液態(tài)，沒有發(fā)生變化。當(dāng)nem影響著乳清蛋白聚合物的形成時，有nem 存在的單一的大豆蛋白經(jīng)過熱處理后所顯示出來的洗脫峰沒有發(fā)生變化，這些現(xiàn)象表明非共價鍵的相互作用在大豆蛋白聚合物中起著重要的作用。 圖7. 蛋白比例為70：30的混合樣90處理10min，離心所得上清液和沉淀的凝膠電泳圖。還原狀態(tài)（a）非還原狀態(tài)（b）。帶1：混合樣上清液；帶2：大豆蛋白控制樣上清液；帶3：乳清蛋白控制樣上清液

22、；帶4：添加nem的混合樣上清液；帶5：添加nem的大豆蛋白控制樣上清液；帶6：添加nem的乳清蛋白控制樣上清液；帶7：混合樣沉淀；帶8：添加nem的混合樣沉淀；帶9：乳清蛋白控制樣沉淀；帶10：添加nem的乳清蛋白控制樣沉淀。注：大豆蛋白控制樣的沉淀因沒有含有足夠量的蛋白而不進(jìn)行分析。圖7描繪了70：30蛋白比例的混合物經(jīng)當(dāng)有nem存在與否，經(jīng)熱處理后的可溶性和不可溶性復(fù)合物的電泳變化圖。有nem存在的單一的大豆蛋白控制樣經(jīng)熱處理后不影響可溶性部分的電泳圖（帶2和帶5）。換句話說，當(dāng)有nem存在的乳清蛋白控制樣經(jīng)熱處理后，其可溶性部分存有較多量原來的乳清蛋白（帶3和帶6）。不可溶片段分析表明

23、-乳白蛋白和-乳球蛋白主要是通過二硫鍵形成復(fù)合物。當(dāng)有nem存在經(jīng)過熱處理，僅有-乳球蛋白存在于乳清蛋白控制樣中。70：30大豆/乳清蛋白混合物經(jīng)熱處理時nem影響著大多數(shù)可溶性大豆蛋白的存在（帶1和4）。這些結(jié)果似乎表明70：30的大豆/乳清蛋白樣品是通過二硫鍵形成可溶性復(fù)合物的。這些可溶性復(fù)合物含有乳清蛋白，但也有可能一些大豆蛋白也參與形成了可溶性復(fù)合物。70：30比例的蛋白混合物的沉淀當(dāng)有nem存在與否，經(jīng)熱處理后結(jié)果有所不同（帶7和帶8）。與熱處理后乳清蛋白控制樣所顯示的結(jié)果一樣，僅當(dāng)二硫鍵存在時，-乳白蛋白存在于沉淀中。并且，當(dāng)有nem存在經(jīng)熱處理時，大豆蛋白的酸性和基本片段11s似

24、乎有少量存在于沉淀中。當(dāng)不可溶部分在非還原狀態(tài)下進(jìn)行分析，雖然二硫鍵是形成含有-乳白蛋白和11s片段蛋白的必須條件，但一些7s和-乳球蛋白轉(zhuǎn)移到凝膠中，證明非共價鍵的相互影響在復(fù)合物的形成中也起著重要的作用。 圖8：蛋白比例為30：70的混合物離心后的上清液蛋白洗脫曲線（實(shí)粗線）；總蛋白濃度為30%乳清蛋白控制樣（實(shí)細(xì)線）；總蛋白濃度為70%大豆蛋白控制樣（點(diǎn)線）。a圖未經(jīng)加熱處理；b圖90加熱10min;c圖90加熱60min。 圖8描述了30：70蛋白比例的混合樣品與乳清蛋白和大豆蛋白控制樣的色譜比較圖。乳清蛋白在180min時出現(xiàn)了與-乳白蛋白和-乳球蛋白相對應(yīng)的兩個不分開的洗脫峰。未經(jīng)熱處理的大豆/乳清蛋白混合樣與大豆蛋白和乳清蛋白控制樣的色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果與70：30蛋白比例混合物類似，混合后的蛋白樣品未經(jīng)加熱沒有產(chǎn)生聚合