科研論文格式與范文1

1、自身免疫性感音神經(jīng)性聾基因治療的實驗研究發(fā)表時間：2009-6-5 14:45:50瀏覽次數(shù):174來源：中國創(chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)推薦蔡文君，譚長強，玉瑾，黃和，霜醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科暨耳鼻咽喉科學(xué)研究室，210029：工業(yè)大學(xué)生物化學(xué)中心，210009 【擅要】 目的研究以重組復(fù)制缺陷型腺病毒為載體的Fas配體（Fas Ligand.即Fast）基因和白細胞 介素10（即IL 10基因治療實騷性自身免疫性感音神經(jīng)性聾。方法：采用同種耳組織抗原加弗氏佐劑免疫 豚穩(wěn)，逍成自身免疫性感音神經(jīng)性査的動物模型28只.按史對設(shè)計將其分為4組，通過鼓階徹量注射的方式， A組注入攜帶FasL基因的腺病毒（A

2、d FasL）. B組注入攜帶IL 10基因的腺病毒（Ad IL 10）, C組單純 注入腺病毒（攜帶綠色熒光蛋白，即Ad GFP）, D組注入等量的磷酸鹽緩沖液。基因?qū)?d后行聽覺腦干 誘發(fā)電位（ABR）測試，后取題骨制作石蠟切片并行HE染色和光鏡觀察，毎組各取兩耳行螺旋韌帶和基底殯 透射電鏡觀察。每組各取3只（6耳）行免疫熒光和酶免疫組織化學(xué)試騷，以檢測基因產(chǎn)物表達和脫病毒轉(zhuǎn)染 情況。結(jié)果：免疫組織化學(xué)顯示攜帶目的基因的腺病毒可以轉(zhuǎn)鍥血管紋.螺族韌帶、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、 蝸軸小血管周國及其耳蝸的骨壁等部位的細胞，并產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物（IL 10和EasL）o ABRI1I波閾值的

3、均 值對比結(jié)果顯示，A組和B組明顯低于C組和D組。耳組織的免疫炎性反應(yīng)亦明顯較C組減輕。結(jié)論：重組 復(fù)制缺陷型腺病毒可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入耳，并在耳表達基因產(chǎn)物.其抑制炎癥反應(yīng)的作用可有效地減輕 自身免疫性感音神經(jīng)性聾的耳組織免疫炎性損傷和聽覺功能障礙，有塑成為治療自身免疫性感音神經(jīng)性金新 的方法和途徑。【關(guān)鍵詞】 基因治療：自身免疫性感音神經(jīng)性聾；豚鼠1979年McCabe依據(jù)其臨床發(fā)現(xiàn)，即18例聽力障礙忠者經(jīng)過免疫抑制治療后聽力有明顯改善.提出了自 身免疫性感音神經(jīng)性（autoimmune sensorineural hearing loss, ASNHL）的概念o之后的進一步研究發(fā)現(xiàn)，

4、自身免疫性損霑不僅可累及耳蝸，還可波及前鹿，故又提出了自身免疫性耳?。╝utoimmune inner ear disease. AIED） 1 2概念。目前ASNHL的病因和發(fā)病機制尚不十分清楚，臨床缺乏特異性診斷方法，對 于ASNHL患者的治療亦存在著一些問題，主要是釆用皮質(zhì)澈素或免疫抑制劑治療，雖然療效較快、較好，但 該類藥物毒副作用多，而且還存在停藥后復(fù)發(fā)率較高等問題。近年來隨著分子生物學(xué)研究的深入和基因工程技術(shù)的進展，基因治療巳成為許多相關(guān)疾病治療硏究方面 的熱點和新希塑?；蛑委熓歉鶕?jù)待定的治療目的基因?qū)NA導(dǎo)入到宿主細胞中并在其中表達。1996年 Lalwani等3 4報道了將

5、基因?qū)雱游锒院箨P(guān)于耳的基因治療成為一個熱點，并在載體選擇、導(dǎo)入 方法和安全性評估等方面取得了很大的進步?；蚬こ碳夹g(shù)巳能構(gòu)建特異性載體，可攜帶治療基因?qū)雱游?耳，在動物耳獲得高效表達4,產(chǎn)生具有高度生物活性的穩(wěn)定的基因產(chǎn)物，并且不產(chǎn)生病毒相關(guān)的耳毒性 反應(yīng)，這為基因治療感音神經(jīng)性聾提供了生物學(xué)證據(jù)。目前因為復(fù)制缺陷性腺病毒載體具有病毒滴度高、轉(zhuǎn)染效率高（100%）、宿主細胞圍廣.外源基因容量 大、穩(wěn)定和無插入突變危險尊待點，巳經(jīng)成為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中應(yīng)用最多的載體之一。Yagi等5將腺病毒 攜帶的GDNF基因從圓窗膜注射入鼓階，GDNF基因在蝸得到表達并發(fā)揮作用?；谏鲜鲅芯繝顩r和現(xiàn)有研究

6、工作基礎(chǔ)，本項目組擬將利用基因治療的獨特性和耳可行局部治療的獨特 解剖特點，對自身免疫性感音神經(jīng)性聾模型動物進行耳免疫抑制或調(diào)節(jié)基因的試驗性治療硏究，以探討其治 療效果和可能發(fā)生的副反應(yīng)惜況。1材料和方法1.1實驗動物健康成熟豚鼠，白色紅目，體1300 g左右，耳廉反應(yīng)正常，耳技檢查排除中耳疾患，所有動物均由青 龍山養(yǎng)殖場提供。1. 2 耳組織粗制抗原（crude inner ear antigens, ClEAgs）制備 豚覆CIEAgs制取方法參考文獻4,主要步驟：將豚鼠清醒斷頭，取出瀕骨，快速打開聽泡，在解剖顯微鏡下分吏全，膜迷路，包括基底膜、 螺旋韌帶、膜半規(guī)管、橢圓囊和球董（祛除耳石

7、器），放入0.01 mol - L-l pH 7.4 PBS中，經(jīng)硏磨、凍溶、 超聲粉碎、勻漿、離心（1 000 r-min-L 5 min）后取上清液，釆用紫外分光光度計測定蛋白含量，分裝 后低盪干燥制成CIEAgs干粉備用，保存于-80 X：冰箱。1.3 ASNHL動物模型総備首次免疫每只動初釆用CIEAgs 400 mg - （0.4 ml） -1.加等量完全弗氏佐劑，注射于右后足墊：2周后 以CIEAgs 200 mg - （0.4ml） -1加等量不完全弗氏佐劑，注射于背部多點皮下；問隔2周后，再同樣強化免 疫1次。依據(jù)聽覺誘發(fā)電位III波的阿值升高（超過免疫前全部動物均值加2倍標準

8、差）和出現(xiàn)針對CIEAgs # 異性抗體（EL1SA法，波長490 nm時A值超過免疫前全部動物均值加2倍標準差人判斷為ASNHL模型動物制 備成功6o1.4實驗設(shè)計ASNHL模型動仙共28只，按配對設(shè)計分為4組，每組7只：A、B和C組分別向鼓階注入攜帶FasL基因的 重組腺病毒（Ad Fast）.攜帶IL 10基因的重組腺病毒（Ad IL 10）和攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒 （Ad GFP）； D組（即對照組）用同樣方法僅向鼓階注射獵酸鹽緩沖液。1.5重組基因載體鼓階注射末次免疫后2周進行。豚鼠用1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（30mgkgT）后，在耳廓后方作一長34 cm弧形切口，顯露聽泡，用

9、徹型電鉆打開聽泡，暴霍耳蝸底轉(zhuǎn)，用針尖輕輕磨薄耳蝸鼓階側(cè)壁的骨壁，鉆一 針尖大小的孔，用徽推進器將小兒頭皮針的針尖（針尖嶄面巳打瘠變?。┎迦牍碾A，深度不超過lnim,先抽 取少量（約10 Ml）的外淋巳液，再用徽量注射機將重組腺病毒或腺病毒液緩慢（1 Hi - min-1）注入鼓階， A組給予Ad FASL （病毒滴度為2.5X10 lOpfu ml-1） 20 M U B組給予Ad IL 10 （病毒滴度為1.0X108 pfu ml-1） 20 uh C組給予AD GFP （病毒滴度為1.0X109 pfu ml-1） 20 U 1. D組給予等量的磷酸鹽 緩沖液骨蠟封閉耳蝸底轉(zhuǎn)，抗生素沖

10、洗中耳腔3次，部分局部放置氧簸沙星明膠海綿預(yù)防感染。骨蠟封閉聽 泡骨孔，逐層縫合傷口。所有梁作應(yīng)嚴格遵守?zé)o苗原則。1.6特異性免疫反應(yīng)測試釆州酶脫免疫吸附試鞭（ELISA）測定特異性抗體。分別于免疫前和末次免疫后2周迸行。心號釆血，分 離血清。用100 Ug-ml-1的CIEAgs溶液包被ELISA板，于4 t過夜并封閉，加入1 ： 10稀釋的豚鼠宜清37 X? 下解育2h,洗板4次，加入1 ： 2 000稀釋的辣根過敦化物酶標記的葡萄球菌蛋白A （Staphylococcal protein A HRP. SPA HRP） 37 X：下孵育1 h,洗板4次，以鄰苯二胺 過氧化氫溶液為底物顯色

11、10 min后用H2SO4 終止顯色，在酶標儀下測定波長為490 run的吸光度A值。1. 7聽覺腦誘發(fā)電位（auditoi-y brain stem response, ABR）測試 分別于免疫前、末次免疫 后2周和鼓階注射后（1周），釆用聽覺誘發(fā)電位測試系統(tǒng)，豚紋頭頂冠狀縫與矢狀縫交界處插入針形電極作 為測試電極，參考電極豈于耳廉后方靠近乳突尖，接地電極豈于對測乳突，刺澈聲信號釆用Click,重復(fù)頻 率為11次min-1.疊加2 048次，記錄時程10 ms.測定川波的閾值.潛伏期和波幅。1.8耳光鏡觀察各組聽覺測試后各取3只豚亂，麻醉后斷頭，立即取出潁骨，打開聽泡，放置于4%多聚甲醛因定

12、液中，12 h后換EDTA脫鈣710d,修剪后流水沖洗12h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、定向包埋。耳蝸中軸切片， 片厚5 Pm,漂片.撈片、粘片，常規(guī)HE染色，封片，光鏡觀察。1.9免疫組織化學(xué)試驗1.9.1耳石蠟包埋各組于聽覺測試后各取豚鼠3只，麻醉、斷頭迅速取額骨，打開聽泡，放置于4% 多聚甲輕固定液中，用針挑開圓窗，在蝸尖鉆一小孔，快速灌注數(shù)次，固定12 h,釆用EDTA脫鈣7-10 d. 修剪后流水沖洗12 h,常規(guī)脫水、透明.浸蠟、定向包埋。1.9.2免疫熒光化學(xué)試駿 將C組2只動物的潁骨蠟塊行耳蝸中軸切片，片厚5 um,漂片、撈片、粘 片后常規(guī)脫蠟至水，在倒置熒光顯徼鏡下觀察和攝片。1

13、.9.3酶免疫組織化學(xué)試驗 按上述方法獲得切片，用（0.2%）修復(fù)抗原，余具體步驟：正常山 羊血清封閉10 mint加PBS祐釋的第一抗體（A組加入兔抗鼠FASL, B組加入兔抗M. 1L 10, C、D組加入兔 抗亂FASL和兔抗鼠IL 10兩種抗體），TC過夜，PBS洗5minX3次，加入IIRP標記的SPA作為二抗，37 C 解育30 min, PBS洗5 minX3次，DAB染色，封片劑封片，光學(xué)顯徼鏡觀察攝片。以上試劑均購買自博士德 生物工程。1.10耳透射電鏡觀察各組聽覺試菽后各取1只豚鼠，麻醉后斷頭，迅速取出額骨，經(jīng)IS定后取出全耳腹迷路（螺族韌帶、血 管紋），后固定、脫水.浸透

14、、樹脂定向包埋，聚合后修整包埋塊，超薄切片，染色后透射電鏡觀察疑片。2結(jié) 果2.1特異性免疫反應(yīng)試驗結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：與免疫前相比，各實驗組和對照組免疫后抗體水平均明顯升高，差異有顯著性（配 對t檢騷，P0. 05K表1各 組血清中針對CIEAgs特異性抗體水平2.2聽覺功能以ARB的III波及應(yīng)閩作為評定聽力水平的指標，結(jié)果見表2。與免疫前相比，免疫后各組ABR平均閾值 升高，差異均有顯著性（t檢驗，P0.05）o與耳抗原免疫后相比，A組和B組耳局部基因治療后ABR平均 閩值降低，差異亦均有顯著性（t檜騷，P005）。C組利D組耳局部給藥前后對比，差異無顯著性。各組同期左右耳對比差異均無

15、顯 著性（t檢輕，P005）。A組和B組分別以其免疫后的ABR平均網(wǎng)值減2倍標準差作為判斷治療后聽覺功能 改善標準，A組有3只（5耳）、B組有2只（3耳）經(jīng)局部基因治療后聽覺功能明顯提高，治療有效率分別為35.71%（5耳/14耳）和23.08% （3耳/13耳），B組1耳并發(fā)感染不計。同樣分別以C組和D組免疫后的ABR平均閾值 減2倍標準差作為判斷治療后聽覺功能改菩標準，耳局部給藥后，未發(fā)現(xiàn)有明顯聽力功能提高耳。表2各組 ABR測試結(jié)果2.3耳光鏡觀察結(jié)果見圖1。C組和D組出現(xiàn)較為顯著的耳組織炎癥反應(yīng)，包括：出現(xiàn)Rosentha 1管中炎癥細胞（以單個細胞 為主）浸潤，螺族神經(jīng)節(jié)細胞變少，耳

16、蝸頂回骨壁及血管紋有散在的黃色含鐵血黃素顆粒，部分動物蝸管或 鼓階可見絮狀物沉積，蝸管出現(xiàn)“漂浮細胞o Corti器和血管紋來見明顯異常。A組和B組的炎癥反應(yīng)明 顯較C組和D組為輕，尤其是聽覺功能改善耳，僅在蝸軸血管周圍有部分單個核細胞浸潤，但螺旋神經(jīng)節(jié)細 胞數(shù)基本正常，Corti器和血管紋未見明顯異常。鼓階見部分絮狀物，但未見“漂浮細胞2.4免疫組織化學(xué)試驗2. 4.1免疫熒光試駿 見圖2。結(jié)果顯示：C組見明顯熒光顯示的部位主要分布于耳蝸骨壁、骨螺旅板 的蝸管唇部.螺旋韌帶和血管紋等部位。2. 4.2酶免疫組織化學(xué) 見圖3。結(jié)果顯示：A組主要顯色反應(yīng)（即FASL表達）部位包括螺旅神經(jīng)節(jié)、 C

17、orti器、血管紋、蝸軸小血管周國、耳蝸骨壁以及壺腹皤等。B組主要顯色反應(yīng)（即IL 10表達）部位包 括血管紋、螺故韌帶、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)以及耳蝸的骨壁。C組和D組僅在螺族神經(jīng)節(jié)和耳蝸骨壁有較 弱的顯色。2.5透射電鏡攝片結(jié)果各組顯示均未出現(xiàn)特殊的細胞和細胞結(jié)構(gòu)的病理變化，僅見C組的1耳血管紋上皮細胞部分線粒體腫脹 （圖4）。3討 論目前ASNHL的發(fā)病機制尚不完全清楚，但對許多自身免疫性疾病的發(fā)生和病理變化研究中發(fā)現(xiàn)，部分細 胞因子起著重要作用。巳有實卷表明IL 10等免疫調(diào)節(jié)分子在自身免疫性疾病的預(yù)防和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎. 多發(fā)性硬化.自身免疫性甲狀腺炎及自身免疫性眼葡萄膜炎等動物模型

18、的基因治療中取得了良好的效果 7 8。我們巳成功構(gòu)建了 ASNHL的動物模型9,本項實驗研究采用豚鼠的同種耳抗原免疫后，成功地 造成部分實菽動揚出現(xiàn)感音神經(jīng)性聾和血清特異性抗體水平升高，即制成了 ASNHL動物模型。再將重組腺病 毒攜帶免疫調(diào)節(jié)分子基因（即抗炎癥分子的基因Ad IL 10和干擾自身免疫反應(yīng)信號傳遞過程并可導(dǎo)致細 .腹程序性死亡的分子基因（即調(diào)控細胞凋亡分子的基因Ad FasL）采用鼓階注射的方法導(dǎo)入豚鼠耳，并于導(dǎo) 入后7 d測試實驗動物的聽覺功能、耳組織中病毒糕染和導(dǎo)入基因產(chǎn)物的表達情況。結(jié)果顯示ASNHL實驗動 物經(jīng)耳局部注射攜帶免疫調(diào)節(jié)基因的重組腺病毒后，部分實驗動物的聽覺

19、功能明顯提高，即ABRIII波閾值降 低，組問閾值的均值對比，均較對照組有顯著性差異。耳蝸病理組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)兩個實駿組動物的耳免 疫炎性反應(yīng)亦較對照組動物為輕，僅見部分實驗動物出現(xiàn)蝸管絮狀物，未出現(xiàn)甥義神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量變化， Corti器和血管紋形態(tài)基本正常，從而提示耳局部的免疫調(diào)節(jié)基因治療具有較好的效果，即調(diào)節(jié)和抑制了由 于自身免疫所適成的耳炎性反應(yīng)和損傷，進而逆轉(zhuǎn)和提高了聽覺功能。耳免疫組織化學(xué)試驗結(jié)果顯示，重組腺病毒可以成功轉(zhuǎn)染豚鼠耳，主要分布于耳蝸骨壁、骨螺族板的蝸 管唇部、螺族韌帶和血管紋等部位。FasL基因表達產(chǎn)物主要分布于螺旅神經(jīng)節(jié)、Corti器.血管紋、蝸軸小 血管周圍、耳蝸

20、骨壁以及壺腹堵等部位。IL 10基因產(chǎn)物主要分布于血管紋、螺旋韌帶、Corti器、螺族神 經(jīng)節(jié)以及耳蝸的骨壁。基因產(chǎn)物表達于殼子.耳蝸血管紋、螺徒韌帶、Corti器.小血管周圍。單一鼓階的 一點注射可以較為廣泛地分布于耳各部位組織中，依據(jù)耳解剖甞和組織學(xué)特點，我們推測可能有3個途徑使 腺病毒從鼓階分布到蝸管：（1通過骨螺旋板下層中的小孔與鼓階的外淋巳液相交通；（2）通過蝸神經(jīng)纖維 穿過的細孔與鼓階的外淋巴液相交通：（3）鼓階和前鹿階在頂回以蝸孔相交通，蝸管中的淋巳液通過前鹿膽 與外淋巴液相交通。具體實際情況有待進一步研究和探明。另一有趣的現(xiàn)象是兩個實卷治療組的動揚免疫組織化甞試卷結(jié)果顯示，在耳

21、蝸的骨壁均有顯著的病毒轉(zhuǎn) 染和免疫調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的表達，具體機制尚不清楚。依據(jù)本組在以往實驗研究中的發(fā)現(xiàn)，即同種耳組織抗原 免疫豚鼠后，部分實驗動物的耳蝸骨壁出現(xiàn)明顯的炎性病灶10（與骨硬化癥的病變極為相似，從而支持 該病的自身免疫性病因?qū)W假說人此次基因治療的方法對于自身免疫性耳哽化癥是否能發(fā)揮一定的治療效果. 有待進一步研究證實。此次實驗研究中，我們對于一組ASNHL的實驗動物鼓階單純注射腺病毒后，結(jié)果顯示聽覺功能無顯著變 化，耳病理形態(tài)學(xué)改變與耳局部注射緩沖液的對照組相似，即提示腺病毒對于ASNIIL治療無顯著效果，但亦 來適成進一步損傷?！緟⒖嘉墨I】1 McCABE B F. Autoim

22、mune sensorineural hearing loss J . Ann Otol Rhinol lmyrgol. 1979.88:585589.2 McCABE B F. Autoimmune inner ear disease： therapy J .Am J Otol,1989,10：196197.3 L?LWANI A Kt WALSH B J, REILLY P G, et al. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders : introduction of adeno associated virus into the guinea pig JGene TherJ996.3：588 592.4 RAPHAEL Yt HRISANCHO J C.ROESSLER B J. Adenoviral mediated gene transfer into guinea pigcochlear cells in vivo J . Neurosci Lett, 1996, 207：137141.5 YAGI M.MAGAL E.SHENG Z.et al.