基因組測序技術(shù)和基因識別

1、基因組測序技術(shù)和基因識別 主要內(nèi)容 一、基因組測序技術(shù) 二、基因識別 一、基因組測序技術(shù) 大規(guī)模DNA測序技術(shù)使全基因組的測序成為可能。 現(xiàn)有測序儀所能測得的序列長度有限，一般500- 1000bp。而基因組序列長度遠(yuǎn)大于此，必須經(jīng)過下 列過程才能測得： 打碎測序拼接 鳥槍法 雜交測序法 1、鳥槍法 鳥槍法（shotgun method）,也稱霰彈法。將DNA 分子打碎，得到長度在500-1000bp之間的小片段， 對這些片段測序，然后根據(jù)他們之間的關(guān)系進(jìn)行 拼接，得到最終目標(biāo)序列。 序列片段覆蓋待測序列序列片段覆蓋待測序列 序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊。序列片段之間也存在著相互覆蓋或

2、者重疊。 目標(biāo)序列目標(biāo)序列 序列碎片序列碎片 拼接過程 以每個(gè)片段為頂點(diǎn)，在每個(gè)頂點(diǎn)之間畫有向邊，有向邊的 權(quán)值代表交疊的字符d 得到三發(fā)送個(gè)數(shù)，方向由交疊序列 前片段指向后片段。 AGGTCC TAAA AGG TCCTAAA AGGTCCTAAA AGGTCCTAAA 1 3 4 1 1 1 3 拼接過程 查找能順箭頭方向依次經(jīng)過各頂點(diǎn)的所有通路中權(quán)值之和 最大的，即為拼接后的序列。 1 adbc，權(quán)值8 2 bcad，權(quán)值7 3 badc，權(quán)值5 4 cadb，權(quán)值10 5 dbca，權(quán)值8 拼接結(jié)果：AGGTCCTAAA 最大權(quán)的哈密頓路徑問題（Hamilton tour proble

3、m） AGGTCCTAAA AGGTCCTAAA 1 3 4 1 1 1 3 ab cd 2、雜交測序法 雜交測序法（sequencing by hybridization，SBH） 基本原理是：構(gòu)建基因微陣列（microarray，也稱基因芯 片，gene chip），讓待測序列與其反應(yīng)，然后由反應(yīng)獲 得的信息確定待測序列的局部序列，最后根據(jù)這些局部序 列重構(gòu)目標(biāo)序列。 基因微陣列（microarray，也稱基因芯片，gene chip）， 將高密度DNA片段陣列以一定的排列方式使其附著在基片 上而形成。 AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT C

4、G CC AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT CG CC GCAC CTGA ACTG CACT 目標(biāo)序列：CGTGACT 互補(bǔ)序列：GCACTGA 由測出的局部序列：GCAC、ACTG、CTGA、CACT，可 以重構(gòu)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列GCACTGA ，從而得到目標(biāo)序 列 CGTGACT 。 可用求最大權(quán)值的哈密頓路徑的方法求解。 也可用歐拉路徑的方法求解，該算法較省時(shí)。 3、拼接軟件 Phred、Phrap、Consed Sequencher ContigExpress 1 aggtcc 2 taaa 3

5、 agg 4 tcctaaa 二、基因識別二、基因識別 基因組（基因組（genome）是指一個(gè)生物體、細(xì)胞或病毒）是指一個(gè)生物體、細(xì)胞或病毒 的整套基因。的整套基因。 基因組學(xué)（基因組學(xué)（genomics）以基因組分析為手段，研）以基因組分析為手段，研 究基因組的構(gòu)成、時(shí)序表達(dá)模式和功能，并提供有究基因組的構(gòu)成、時(shí)序表達(dá)模式和功能，并提供有 關(guān)生物物種及其細(xì)胞功能的進(jìn)化信息。關(guān)生物物種及其細(xì)胞功能的進(jìn)化信息。 功能基因組學(xué)研究基因和非編碼序列生物學(xué)功能。功能基因組學(xué)研究基因和非編碼序列生物學(xué)功能。 比較基因組學(xué)通過生物物種基因組之間的比較，研比較基因組學(xué)通過生物物種基因組之間的比較，研 究基因

6、的功能。究基因的功能。 基因識別是識別基因識別是識別DNA序列上的具有生物學(xué)特序列上的具有生物學(xué)特 征的片段，是基因組研究的基礎(chǔ)。征的片段，是基因組研究的基礎(chǔ)。 基因識別是生物信息學(xué)領(lǐng)域里的一個(gè)重要研基因識別是生物信息學(xué)領(lǐng)域里的一個(gè)重要研 究內(nèi)容究內(nèi)容 基因識別問題，在近幾年受到廣泛的重視基因識別問題，在近幾年受到廣泛的重視 當(dāng)人類基因組研究進(jìn)入一個(gè)系統(tǒng)測序階段時(shí)，急需當(dāng)人類基因組研究進(jìn)入一個(gè)系統(tǒng)測序階段時(shí)，急需 可靠自動的基因組序列翻譯解釋技術(shù)，以處理大量可靠自動的基因組序列翻譯解釋技術(shù)，以處理大量 已測定的但未知功能或未經(jīng)注釋的已測定的但未知功能或未經(jīng)注釋的DNA序列序列 1、原核基因識別

7、、原核基因識別 原核基因特點(diǎn)：基因密度高、簡單（絕大多數(shù)不含內(nèi)含子）。原核基因特點(diǎn)：基因密度高、簡單（絕大多數(shù)不含內(nèi)含子）。 其重點(diǎn)在于識別編碼區(qū)域其重點(diǎn)在于識別編碼區(qū)域 非翻譯區(qū)域（非翻譯區(qū)域（untranslated regions, UTR） 編碼區(qū)域兩端的編碼區(qū)域兩端的DNA，有一部分被轉(zhuǎn)錄，但是不被翻譯，有一部分被轉(zhuǎn)錄，但是不被翻譯， 這一部分稱為非翻譯區(qū)域這一部分稱為非翻譯區(qū)域 5UTR-基因上游區(qū)域的非翻譯區(qū)域基因上游區(qū)域的非翻譯區(qū)域 3UTR-基因下游區(qū)域的非翻譯區(qū)域基因下游區(qū)域的非翻譯區(qū)域 對于任何給定的核酸序列（單鏈DNA或mRNA）， 根據(jù)密碼子的起始位置，可以按照三種方

8、式進(jìn)行解 釋。 例如，序列ATTCGATCGCAA 這三種閱讀順序稱為閱讀框（reading frames） CAA A ATTCGATCG ATTCGATCGCAA ATTCGATCGCA （1） （3） （2） 一個(gè)開放閱讀框（一個(gè)開放閱讀框（ORF,open reading frame）是一個(gè)沒有）是一個(gè)沒有 終止編碼的密碼子序列。終止編碼的密碼子序列。 原核基因識別任務(wù)的重點(diǎn)是識別開放閱讀框，或者說識別長原核基因識別任務(wù)的重點(diǎn)是識別開放閱讀框，或者說識別長 的編碼區(qū)域。的編碼區(qū)域。 基于基因密碼子特性的識別方法基于基因密碼子特性的識別方法 辨別編碼區(qū)域與非編碼區(qū)域的一種方法辨別編碼區(qū)域

9、與非編碼區(qū)域的一種方法 是檢查終止密碼子的出現(xiàn)頻率是檢查終止密碼子的出現(xiàn)頻率 終止密碼子出現(xiàn)的期望次數(shù)為：終止密碼子出現(xiàn)的期望次數(shù)為： 每每21個(gè)（個(gè)（ 64/3）密碼子出現(xiàn)一次終止密碼子）密碼子出現(xiàn)一次終止密碼子 基本思想：基本思想： 如果能夠找到一個(gè)比較長的序列，其相應(yīng)的密碼子序列不含如果能夠找到一個(gè)比較長的序列，其相應(yīng)的密碼子序列不含 終止密碼子，則這段序列可能就是編碼區(qū)域。終止密碼子，則這段序列可能就是編碼區(qū)域。 基本算法：基本算法： 掃描給定的掃描給定的DNA序列，在三個(gè)不同的閱讀框中尋找較長的序列，在三個(gè)不同的閱讀框中尋找較長的 ORF。遇到終止密碼子以后，回頭尋找起始密碼子。遇到

10、終止密碼子以后，回頭尋找起始密碼子。 這種算法過于簡單，不適合于處理短的這種算法過于簡單，不適合于處理短的ORF或者交疊的或者交疊的ORF。 識別編碼區(qū)域的另一種方法是分析各種密碼子出現(xiàn)識別編碼區(qū)域的另一種方法是分析各種密碼子出現(xiàn) 的頻率的頻率 將一個(gè)隨機(jī)均勻分布的將一個(gè)隨機(jī)均勻分布的DNA序列翻譯成氨基酸序列翻譯成氨基酸 序列，則在氨基酸序列中上述序列，則在氨基酸序列中上述3種氨基酸出現(xiàn)的種氨基酸出現(xiàn)的 比例應(yīng)該為比例應(yīng)該為6:4:1 例如，亮氨酸、丙氨酸、色氨酸分別有例如，亮氨酸、丙氨酸、色氨酸分別有 6個(gè)、個(gè)、4個(gè)和個(gè)和1個(gè)密碼子個(gè)密碼子 但是在真實(shí)的氨基酸序列中，上述比例并不但是在真實(shí)

11、的氨基酸序列中，上述比例并不 正確正確 這說明這說明DNA的編碼區(qū)域并非隨機(jī)的編碼區(qū)域并非隨機(jī) 假設(shè)在一條假設(shè)在一條DNA序列中已經(jīng)找到所有的序列中已經(jīng)找到所有的ORF， 那么可以利用密碼子頻率進(jìn)一步區(qū)分編碼那么可以利用密碼子頻率進(jìn)一步區(qū)分編碼ORF和和 非編碼非編碼ORF 利用這種方法，可以計(jì)算一個(gè)利用這種方法，可以計(jì)算一個(gè)ORF成為編碼區(qū)域成為編碼區(qū)域 的可能性。的可能性。 基于編碼區(qū)域堿基組成特征的識別方法基于編碼區(qū)域堿基組成特征的識別方法 編碼序列與非編碼序列在堿基組成上有區(qū)別編碼序列與非編碼序列在堿基組成上有區(qū)別 單個(gè)堿基的組成比例單個(gè)堿基的組成比例 多個(gè)堿基的組成多個(gè)堿基的組成 通

12、過統(tǒng)計(jì)分析識別編碼序列通過統(tǒng)計(jì)分析識別編碼序列 2 2、真核基因識別問題、真核基因識別問題 真核基因遠(yuǎn)比原核基因復(fù)雜：真核基因遠(yuǎn)比原核基因復(fù)雜： 一方面，真核基因的編碼區(qū)域是非連續(xù)的，編碼區(qū)一方面，真核基因的編碼區(qū)域是非連續(xù)的，編碼區(qū) 域被分割為若干個(gè)小片段。域被分割為若干個(gè)小片段。 另一方面，真核基因具有更加豐富的基因調(diào)控信息，另一方面，真核基因具有更加豐富的基因調(diào)控信息， 這些信息主要分布在基因上游區(qū)域。這些信息主要分布在基因上游區(qū)域。 基因識別基本思路基因識別基本思路 找出基因兩端的功能區(qū)域找出基因兩端的功能區(qū)域: 轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)轉(zhuǎn)錄啟動區(qū) 終止區(qū)終止區(qū) 在啟動區(qū)下游位置尋找翻譯起始密碼子在

13、啟動區(qū)下游位置尋找翻譯起始密碼子 識別轉(zhuǎn)錄剪切位點(diǎn)識別轉(zhuǎn)錄剪切位點(diǎn) 剪切給體位點(diǎn)剪切給體位點(diǎn) 剪切接受體位點(diǎn)剪切接受體位點(diǎn) 各種不同的方法有不同的適應(yīng)面，而不同的方法有各種不同的方法有不同的適應(yīng)面，而不同的方法有 時(shí)可以結(jié)合起來以提高基因識別的準(zhǔn)確率。時(shí)可以結(jié)合起來以提高基因識別的準(zhǔn)確率。 關(guān)鍵問題是如何提高一個(gè)識別算法的敏感性關(guān)鍵問題是如何提高一個(gè)識別算法的敏感性 （sensitivity，Sn）和特異性（）和特異性（specificity，Sp）。）。 3 3、基因識別的主要方法、基因識別的主要方法 兩大類識別方法：兩大類識別方法： 從頭算方法（或基于統(tǒng)計(jì)的方法）從頭算方法（或基于統(tǒng)計(jì)的方

14、法） 根據(jù)蛋白質(zhì)編碼基因的一般性質(zhì)和特征進(jìn)行識別，通過統(tǒng)計(jì)值區(qū)分根據(jù)蛋白質(zhì)編碼基因的一般性質(zhì)和特征進(jìn)行識別，通過統(tǒng)計(jì)值區(qū)分 外顯子、內(nèi)含子及基因間區(qū)域外顯子、內(nèi)含子及基因間區(qū)域 基于同源序列比較的方法基于同源序列比較的方法 利用數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有與基因有關(guān)的信息（如利用數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有與基因有關(guān)的信息（如EST序列、蛋白質(zhì)序列），序列、蛋白質(zhì)序列）， 通過同源比較，幫助發(fā)現(xiàn)新基因。通過同源比較，幫助發(fā)現(xiàn)新基因。 最理想的方法是綜合兩大類方法的優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)混合最理想的方法是綜合兩大類方法的優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)混合 算法。算法。 基因識別方法有基因識別方法有 ： （1）基于規(guī)則的系統(tǒng)）基于規(guī)則的系統(tǒng) （2） 語義學(xué)方法

15、語義學(xué)方法 （3） 線性辨別分析（線性辨別分析（LDA） （4） 決策樹決策樹 （5） 動態(tài)規(guī)劃動態(tài)規(guī)劃 （6） 隱馬爾柯夫模型隱馬爾柯夫模型 （7） 剪切對比排列剪切對比排列 （spliced alignment） 4、基因識別程序介紹 表表5.7 基因識別程序及訪問地址基因識別程序及訪問地址 （HP主頁；主頁；ESE-mail服務(wù)器；服務(wù)器；WSweb服務(wù)器；服務(wù)器；CL客戶客戶/服務(wù)器協(xié)議；服務(wù)器協(xié)議； EX有可執(zhí)行代碼；有可執(zhí)行代碼；SC有源代碼）有源代碼） 表表5.8 各程序的性能比較（敏感性各程序的性能比較（敏感性(1)被預(yù)測出的真實(shí)編碼核酸的被預(yù)測出的真實(shí)編碼核酸的%； 敏感性敏

16、感性(2)被正確識別出的編碼外顯子的被正確識別出的編碼外顯子的%； 特異性特異性(1)預(yù)測出的編碼核酸為真實(shí)編碼核酸的預(yù)測出的編碼核酸為真實(shí)編碼核酸的%； 特異性特異性(2)預(yù)測出外顯子為真實(shí)外顯子的預(yù)測出外顯子為真實(shí)外顯子的%） Genscan 訪問： /GENSCAN.html 以核酸序列SEQ5作綜合分析為例 SEQ5SEQ5 seq5 1 gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc tcctgtgcct 61 gccagaagag acagagcttg aggagagctt gagg

17、agagca ggaaaggtgg aacattgctg 121 ctgctgctca ctcagttcca caggtgggag gaacagcagg gcttagagtg ggggtcattg 181 tgcagatggg aaaacaaagg cccagagagg ggaagaaatg cctaggagct accgagggca 241 ggcgacctca accacagccc agtgctggag ctgtgagtgg atgtagagca gcggaatatc 301 cattcagcca gctcagggga aggacagggg ccctgaagcc aggggatgga gc

18、tgcaggga 361 agggagctca gagagaaggg gaggggagtc tgagctcagt ttcccgctgc ctgaaaggag 421 ggtggtacct actcccttca cagggtaact gaatgagaga ctgcctggag gaaagctctt 481 caagtgtggc ccaccccacc ccagtgacac cagcccctga cacgggggag ggagggcagc 541 atcaggaggg gctttctggg cacacccagt acccgtctct gagctttcct tgaactgttg 601 catttta

19、atc ctcacagcag ctcaacaagg tacataccgt caccatcccc attttacaga 661 tagggaaatt gaggctcgga gcggttaaac aactcacctg aggcctcaca gccagtaagt 721 gggttccctg gtctgaatgt gtgtgctgga ggatcctgtg ggtcactcgc ctggtagagc 781 cccaaggtgg aggcataaat gggactggtg aatgacagaa ggggcaaaaa tgcactcatc 841 cattcactct gcaagtatct acggc

20、acgta cgccagctcc caagcaggtt tgcgggttgc 901 acagcggagc gatgcaatct gatttaggct tttaaaggat tgcaatcaag tgggacccac 961 tagcctcaac cctgtacctc ccctcccctc cacccccagc agtctccaaa ggcctccaac 1021 aaccccagag tgggggccat gtatccaaag aaactccaag ctgtatacgg atcacactgg 1081 ttttccagga gcaaaaacag aaacagcctg aggctggtca a

21、aattgaacc tcctcctgct 1141 ctgagcagcc tagggggcag actaagcaga gggctgtgca gacccacata aagagcctac 1201 tgtgtgccag gcacttcacc cgaggcactt cacaagcatg cttgggaatg aaacttccaa 1261 ctctttggga tgcaggtgaa acagttcctg gttcagagag gtgaagcggc ctgcctgagg 1321 cagcacagct cttctttaca gatgtgcttc cccacctcta ccctgtctca cggccc

22、ccca 1381 tgccagcctg acggttgtgt ctgcctcagt catgctccat ttttccatcg ggaccatcaa 1441 gagggtgttt gtgtctaagg ctgactgggt aactttggat gagcggtctc tccgctccga 1501 gcctgtttcc tcatctgtca aacgggctct aacccactct gatctcccag ggcggcagta 1561 agtcttcagc atcaggcatt ttggggtgac tcagtaaatg gtagatcttg ctaccagtgg 1621 aacagc

23、cact aaggattctg cagtgagagc agagggccag ctaagtggta ctctcccaga 1681 gactgtctga ctcacgccac cccctccacc ttggacacag gacgctgtgg tttctgagcc 1741 aggtacaatg actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt acactgccca ggcaaagcgt 1801 ccgggcagcg taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg acttagcccc tgtttgctcc 1861 tccgataact ggggtgacct

24、tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt tgcccctctg 1921 gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct cctcagcttc aggcaccacc 1981 actgacctgg gacagtgaat cgtaagtatg cctttcactg cgaggggttc tggagaggct 2041 tccgagctcc ccatggccca ggcaggcagc aggtctgggg caggaggggg gttgtggagt 2101 gggtatccgc ctgctgaggt gcagggcaga tggag

25、aggct gcagctgagc tcctattttc 2161 ataataacag cagccatgag ggttgtgtcc tgtttcccag tcctgcccgg tcccccctcg 2221 gtacctcctg gtggatacac tggttcctgt aagcagaagt ggatgagggt gtctaggtct 2281 gcagtcctgg caccccagga tgggggacac cagccaagat acagcaacag caacaaagcg 2341 cagccatttc tttctgtttg cacagctcct ctgtctgtcg ggggctcctg

26、 tctgttgtct 2401 cctataagcc tcaccacctc tcctactgct tgggcatgca tctttctccc cttctataga 2461 tgaggaggtt aaggttcaga gaggggtggg gaggaacgcc ggctcacatt ctccatcccc 2521 tccagatatg accaggaaca gacctgtgcc agcctcagcc ttacatcaaa atgggcctcc 2581 ccatgcaccg tggacctctg ggccctcctg tcccagtgga ggacaggaag ctgtgagggg 2641

27、 cactgtcacc cagggctcaa gctggcattc ctgaataatc gctctgcacc aggccacggc 2701 taagctcagt gcgtgattaa gcctcataac cctccaaggc agttactagt gtgattccca 2761 ttttacagat gaggaagatg gggacagaga ggtgaataac tggccccaaa tcacacacca 2821 tccataattc gggctcaggc acctggctcc agtccccaaa ctcttgaacc tggccctagt 2881 gtcactgttt ctct

28、tgggtc tcaggcgctg gatggggaac aggaaacctg ggctgaactt 2941 gaggcctctc tgatgctcgg tgacttcaga cagttgctca acctctctgt tctcttgggc 3001 aaaacatgat aacctttgac ttctgtcccc tcccctcacc ccacccgacc ttgatctctg 3061 aagtgttgga aggatttaat ttttcctgca ctgagttttg gagacaggtc aaaaagatga 3121 ccaaggccaa ggtggccagt ttcctatag

29、a acgcctctaa aagacctgca gcaatagcag 3181 caagaactgg tattctcgag aacttgctgc gcagcaggca cttcttggca ttttatgtgt 3241 atttaatttc acaatagctc tatgacaaag tccacctttc tcatctccag gaaactgagg 3301 ttcagagagg ttaagtaact tgtccaaggt cacacagcta atagcaagtt gacgtggagc 3361 aatctggcct cagagccttt aattttagcc acagactgat gct

30、cccctct tcatttagcc 3421 aggctgcctc tgaagttttc tgattcaaga cttctggctt cagctttgta cacagagatg 3481 attcaatgtc aggttttgga gcgaaatctg tttaatccca gacaaaacat ttaggattac 3541 atctcagttt tgtaagcaag tagctctgtg atttttagtg agttatttaa tgctctttgg 3601 ggctcaattt ttctatctat aaaatagggc taataatttg caccttatag ggtaagct

31、tt 3661 gaggacagat tagatgatac ggtgcctgta aaacaccagg tgttagtaag tgtggcaatg 3721 atggtgacgc tgaggctgtg tttgcttagc atagggttag gcagctggca ggcagtaaac 3781 agttggataa tttaatggaa aatttgccaa actcagatgc tgttcactgc tgagcaggag 3841 ccccttcctg ctgaaatggt cctggggagt gcagcaggct ctccgggaag aaatctacca 3901 tctctcgg

32、gc aggagctcaa cctgtgtgca ggtacaggga gggcttcctc acctggtgcc 3961 cactcatgca ttacgtcagt tattcctcat ccctgtccaa aggattcttt tctccattgt 4021 acagctatga agctagtgct caaagaagtg aagtcattta ccccaggccc cctgccagta 4081 agtgacaggg cctggtcaca cttgggttta tttattgccc agttcaacag gttgtttgac 4141 cataggcgag attctcttcc ct

33、gcaccctg ccgggttgct cttggtccct tattttatgc 4201 tcctgggtag aaatggtgcg agattaggca gggagtggac gcttccctgt ccctggcccc 4261 gcaaagagtg ctcccacctg ccccgatccc agaaatgtca ccatgaagcc ttcattcttt 4321 tggtttaaag cttggcctca gtgtccgtac accatggggt ccttggccag atggcgactt 4381 tctcctctcc agtcgccctc ccaggcacta gctttta

34、gga gtgcagggtg ctgcctctga 4441 tagaagggcc aggagagagc aggttttgga gacctgatgt tataaggaac agcttgggag 4501 gcataatgaa cccaacatga tgcttgagac caatgtcaca gcccaattct gacattcatc 4561 atctgagatc tgaggacaca gctgtctcag ttcatgatct gagtgctggg aaagccaaga 4621 cttgttccag ctttgtcact gacttgctgt atagcctcaa caaggccctg a

35、ccctctctg 4681 ggcttcaaac tcttcactgt gaaaggagga aaccagagta ggtgatgtga caccaggaaa 4741 gatggatggg tgtgggggaa tgtgctcctc ccagctgtca ccccctcgcc accctccctg 4801 caccagcctc tccacctcct ttgagcccag aattcccctg tctaggaggg cacctgtctc 4861 gtgcctagcc atgggaattc tccatctgtt ttgctacatt gaacccagat gccattctaa 4921 c

36、caagaatcc tggctgggtg caggggctct cgcctgtaac cccagcactt tgggaggcca 4981 aggcaggcgg atcaagaggt caggagttca agacctgcct ggccaacacg gtgaaacctc 5041 agctctacta aaaatacaaa aattagccag gcgtggtggc acacgcctgt aatcccagct 5101 atttgggaag ctgagacaga agaatttctt gaacccggga ggtggaggtt tcagtgagcc 5161 gagatcacgc cactgc

37、actc caccctggcg gataaagcga gactctgtct caaaaaaaac 5221 ccaaaaacct atgttagtgt acagagggcc ccagtgaagt cttctcccag ccccactttg 5281 cacaactggg gagagtgagg ccccaggacc agaggattct tgctaaaggc caagtggata 5341 gtgatggccc tgccaggcta gaagccacaa cctctggccc tgaggccact cagcatattt 5401 agtgtcccca ccctgcagag gcccaactcc

38、ctcctgacca ctgagccctg taatgatggg 5461 ggaatttcca taagccatga aggactgcac aaagttcagt tgggagtgaa agagaaatta 5521 aagggagatg gaaatataca gcactaattt tagcaccgtc ttcagttcta acaacactag 5581 ctagctgaag aaaatacaaa catgtattat gtaatgtgtg gtctgttcca tttggattac 5641 ttagaggcac gagggccaag gagaaaggtg gtggagagaa accag

39、ctttg cacttcattt 5701 gttgctttat tggaaggaaa cttttaaaag tccaaggggg ttgaagaatc tcaatatttg 5761 ttatttccag ctttttttct ccagtttttc atttcccaaa ttcaaggaca cctttttctt 5821 tgtattttgt taagatgatg gttttggttt tgtgactagt agttaacaat gtggctgccg 5881 ggcatattct cctcagctag gacctcagtt ttcccatctg tgaagacggc aggttctacc

40、 5941 tagggggctg caggcaggtg gtccgaagcc tgggcatatc tggagtagaa ggatcactgt 6001 ggggcagggc aggttctgtg ttgctgtgga tgacgttgac tttgaccatt gctcggcaga 6061 gcctgctctc gctggttcag ccacaggccc caccactccc tattgtctca gccccgggta 6121 tgaaacatgt attcctcact ggcctatcac ctgaagcctt tgaatttgca acacctgcca 6181 acccctccct

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44、ctagatg 6961 taggattctg gttctgctac ttcctcagtg acattgaata gctgacctaa tctctctggc 7021 tttggtttct tcatctgtaa aagaaggata ttagcattag cacctcacgg gattgttaca 7081 agaaagcaat gaattaacac atgtgagcac ggagaacagt gcttggcata tggtaagcac 7141 tacgtacatt ttgctattct tctgattctt tcagtgttac tgatgtcggc aagtacttgg 7201 cac

45、aggctgg tttaataatc cctaggcact ttcacgtggt gtcaatccct gatcactggg 7261 agtcatcatg tgccttgact cgggcctggc ccccccatct ctgtcttgca ggacaatgcc 7321 gtcttctgtc tcgtggggca tcctcctgct ggcaggcctg tgctgcctgg tccctgtctc 7381 cctggctgag gatccccagg gagatgctgc ccagaagaca gatacatccc accatgatca 7441 ggatcaccca accttcaa

46、ca agatcacccc caacctggct gagttcgcct tcagcctata 7501 ccgccagctg gcacaccagt ccaacagcac caatatcttc ttctccccag tgagcatcgc 7561 tacagccttt gcaatgctct ccctggggac caaggctgac actcacgatg aaatcctgga 7621 gggcctgaat ttcaacctca cggagattcc ggaggctcag atccatgaag gcttccagga 7681 actcctccgt accctcaacc agccagacag cc

47、agctccag ctgaccaccg gcaatggcct 7741 gttcctcagc gagggcctga agctagtgga taagtttttg gaggatgtta aaaagttgta 7801 ccactcagaa gccttcactg tcaacttcgg ggacaccgaa gaggccaaga aacagatcaa 7861 cgattacgtg gagaagggta ctcaagggaa aattgtggat ttggtcaagg agcttgacag 7921 agacacagtt tttgctctgg tgaattacat cttctttaaa ggtaagg

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51、agtg gaggcaagcc aggctgcagt cagcacagct 8761 aaagtcctgg ctctgctgtg gccttagtgg gggcccaggt ccctctccag ccccagtctc 8821 ctccttctgt ccaatgagaa agctgggatc aggggtccct gaggcccctg tccactctgc 8881 atgcctcgat ggtgaagctc tgttggtatg gcagagggga ggctgctcag gcatctgcat 8941 ttcccctgcc aatctagagg atgaggaaag ctctcaggaa

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54、aaggt gcctatgatg aagcgtttag gcatgtttaa catccagcac tgtaagaagc 9541 tgtccagctg ggtgctgctg atgaaatacc tgggcaatgc caccgccatc ttcttcctgc 9601 ctgatgaggg gaaactacag cacctggtaa atgaactcac ccacgatatc atcaccaagt 9661 tcctggaaaa tgaagacaga aggtgattcc ccaacctgag ggtgaccaag aagctgccca 9721 cacctcttag ccatgttggg

55、 actgaggccc atcaggactg gccagagggc tgaggagggt 9781 gaaccccaca tccctgggtc actgctactc tgtataaact tggcttccag aatgaggcca 9841 ccactgagtt caggcagcgc cgtccatgct ccatgaggag aacagtaccc agggtgagga 9901 ggtaaaggtc tcgtccctgg gaacttccca ctccagtgtg gacactgtcc cttcccaata 9961 tccagtgccc aaggcaggga cagcagcacc acca

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57、agtgt atgtgtgtgc 10261 attcgtgatt atgcccatgc cctgctgatc tagttcgttt tgtacactgt aaaaccaaga 10321 tgaaaataca aaaggtgtcg ggttcataat aggaatcgag gctggaattt ctctgttcca 10381 tgccagcacc tcctgaggtc tctgctccag gggttgagaa agaacaaaga ggctgagagg 10441 gtaacggatc agagagccca gagccagctg ccgctcacac cagaccctgc tcaggg

58、tggc 10501 attgtctccc catggaaaac cagagaggag cactcagcct ggtgtggtca ctcttctctt 10561 atccactaaa cggttgtcac tgggcactgc caccagcccc gtgtttctct gggtgtaggg 10621 ccctggggat gttacaggct gggggccagg tgacccaaca ctacagggca agatgagaca 10681 ggcttccagg acacctagaa tatcagagga ggtggcattt caagcttttg tgattcattc 10741 gatgttaaca ttctttgact caatgtagaa gagctaaaag tagaacaaac caaagccgag 10801 ttcccatctt agtgtgggtg gaggacacag gagtaagtgg cagaaataat cagaaaagaa 10861 aacacttgca ctgtggtggg tcccagaa