基因克隆技術(shù)在確定藥物靶點(diǎn)中的應(yīng)用

1、基因克隆技術(shù)在確定藥物靶點(diǎn)中的應(yīng)用 關(guān)思靜 中藥1302 0 【摘要】：隨著人類基因組計(jì)劃的完成，基因克隆技術(shù)的研究，新技術(shù)方法越來越多的用于藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與確證，為藥物設(shè)計(jì)，生物制藥以及用藥方案提供了確切的理論依據(jù)，對促進(jìn)藥物發(fā)現(xiàn)，藥物篩選和藥理學(xué)研究起到了重要的作用。本文論述了反義核酸技術(shù)，RNA干擾技術(shù)，高通量篩選與高內(nèi)涵篩選，轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方法在確定藥物靶點(diǎn)中的作用。【關(guān)鍵詞】：分子生物技術(shù) 靶點(diǎn)確證 分子藥理學(xué) 藥物靶點(diǎn)是指生物體內(nèi)的一類大分子及其特定結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，具有重要的生理功能，其活性可以通過與藥物分子的結(jié)合而改變，并產(chǎn)生預(yù)期的藥理效應(yīng)。在藥物發(fā)現(xiàn)的四個(gè)環(huán)節(jié)中，靶點(diǎn)確證是首要的任務(wù)，

2、也是藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵。隨著生命科學(xué)以及生物技術(shù)的發(fā)展，特別是基因克隆技術(shù)的發(fā)展，為靶點(diǎn)確證提供了有力支持1。分子藥理學(xué)研究的基本理論是受體學(xué)說，受體的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，對于受體的研究可以闡明藥物靶點(diǎn)的機(jī)制，為靶點(diǎn)確證提供理論依據(jù)2。人們對疾病的認(rèn)識達(dá)到基因水平，對藥物作用的認(rèn)識達(dá)到分子水平，而同時(shí)新藥研究也出現(xiàn)了新高潮。細(xì)胞及分子生物學(xué)方法以及基因克隆技術(shù)在基因水平上研究受體生理調(diào)節(jié)和病理變化的分子機(jī)制，受體病的分子基礎(chǔ)以及細(xì)胞內(nèi)受體與DNA相互作用的機(jī)制等。分子生物學(xué)技術(shù)能確定并克隆許多調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因，闡明調(diào)節(jié)蛋白在疾病狀態(tài)下的變化，從而解釋信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，為靶點(diǎn)確證提供了基礎(chǔ)理論與技術(shù)支撐。1

3、，高通量篩選與高內(nèi)涵篩選在藥物靶點(diǎn)基因功能研究中的作用 高通量篩選：此技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程，以靈敏快速儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對數(shù)以千萬樣品檢測，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。目前HTS廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)作用藥靶的活性化合物，評價(jià)先導(dǎo)化合物的選擇性，毒性等多個(gè)藥物開發(fā)階段，并在先導(dǎo)化合物的優(yōu)化等過程中起著重要作用。除與細(xì)胞表形或形態(tài)學(xué)相關(guān)的檢測指標(biāo)外，細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，糖代謝，能量產(chǎn)生和代謝產(chǎn)物分析等代謝通路也是基因功能重要的研究內(nèi)容3.結(jié)合抗體芯片技術(shù)，多路測定技術(shù)等新

4、的檢測方法和熒光成像技術(shù)，定量PCR，高通量熒光激活細(xì)胞分類器等檢測方法和技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，靈敏度和重現(xiàn)性這兩個(gè)高通量篩選的關(guān)鍵問題也逐步得到解決。 高內(nèi)涵篩選是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時(shí)檢測被篩樣品對細(xì)胞形態(tài)，生長，分化，遷移，凋亡，代謝途徑及信號傳導(dǎo)等方面的影響，在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量與基因，蛋白質(zhì)及其他細(xì)胞成分相關(guān)的信息，確定被篩樣品生物活性和潛在毒性的過程。高內(nèi)涵篩選應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)獲得被篩樣品對細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實(shí)時(shí)快速的生物效應(yīng)信息，對其多角度分析的技術(shù)。 HCS是一種基于細(xì)胞層面的、多元的藥物篩選方法,它主要依賴于高分辨率的細(xì)胞成像系統(tǒng),充分整合

5、樣品制備技術(shù)、自動化設(shè)備、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng),檢測試劑,生物信息學(xué)等資源的綜合優(yōu)勢,在細(xì)胞或分子水平上實(shí)現(xiàn)對候選物的多元化、快速化和規(guī)?；Y選。在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下,盡可能同時(shí)檢測被篩選樣品對細(xì)胞生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)環(huán)節(jié)的影響,涉及的靶點(diǎn)包括細(xì)胞的膜受體、胞內(nèi)成分、細(xì)胞器和離子通道等,即從單一試驗(yàn)中獲得大量與候選物藥理學(xué)活性相關(guān)的信息及其潛在毒性作用。與傳統(tǒng)的HTS方法相比，HCS使用單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)構(gòu)等多方面的信息來表征細(xì)胞的生理或病理特性，其還能夠用于亞細(xì)胞群或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面的研究。2反義核酸技術(shù)在藥物靶基因功能鑒定中的應(yīng)用 反義核酸技術(shù)(antisen

6、setechnology)主要包括反義RNA(antisenseRNA)和反義寡核苷酸(anti2senseoligonucleotide),通過多種機(jī)制快速、可預(yù)測地調(diào)節(jié)培養(yǎng)組織或細(xì)胞的基因表達(dá),從而快速、有效地測定基因功能。反義寡核苷酸主要通過RNaseH介導(dǎo)的機(jī)制抑制基因表達(dá)。這種高效的方法已被廣泛用于含有反義寡核苷酸序列樣的靶基因的下調(diào)(downregulation)。實(shí)際上,這種技術(shù)對于鑒定mRNA中的有效靶基因在某種程度上靠經(jīng)驗(yàn),因?yàn)樵S多靶基因不能顯示最佳活性,是一種高通量的基因功能檢定方法。反義技術(shù)廣泛用于體內(nèi)外模型中靶基因功能的驗(yàn)證,可部分替代基因敲除技術(shù)43 RNA干擾技術(shù)

7、RNA干擾技術(shù)能夠有效的介導(dǎo)基因沉默，從而用于靶點(diǎn)確證。通過比較正常細(xì)胞和RNA干擾介導(dǎo)基因沉默的細(xì)胞對藥物的反應(yīng)，可以揭示藥物靶點(diǎn)基因，篩選藥物靶點(diǎn)，也可以闡明藥物作用機(jī)制。美國科學(xué)家安德魯菲爾和克雷格梅洛因RNAi此而獲得2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。RNAi為基因和蛋白功能研究、核酸藥物的分子設(shè)計(jì),藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、疾病基因治療等科學(xué)研究提供了重要手段。RNAi可以高通量地發(fā)現(xiàn)藥物靶基因,從而成為尋找新藥作用靶標(biāo)的有力工具。RNAi可高度特異性地干擾表達(dá)潛在靶點(diǎn)的基因,進(jìn)而干擾機(jī)體疾病的發(fā)生與發(fā)展,其效果與高特異性靶蛋白的抑制效果類似。目前,RNAi已廣泛用于探索發(fā)現(xiàn)治療腫瘤、病毒感染性

8、疾病、神經(jīng)退行性疾病以及血液病等疾病的藥物靶標(biāo)5。siRNA的標(biāo)記、轉(zhuǎn)染和RNAi的檢測等已廣泛用于功能基因組學(xué)、基因治療和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究。4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在藥物作用靶點(diǎn)研究中的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因技術(shù)通常包括基因敲入(knockin)和基因敲除(knockout)兩種方式,基因敲入是指利用基因同源重組，將外原有功能基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞與基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組，插入到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的技術(shù)。基因敲出是指同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，已達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。其顯著特點(diǎn)是分子及細(xì)胞水平操作,組織及動物整體水平表達(dá)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)為體內(nèi)研究

9、藥物對機(jī)體整體的作用提供了很好的技術(shù)手段,在藥物發(fā)現(xiàn)過程中起重要作用。真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染(genetransfer)技術(shù)是研究基因功能的有效手段之一。動物的正常生理依賴于體內(nèi)不同類型細(xì)胞間的相互作用,后者通過細(xì)胞通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)由于一個(gè)基因功能的實(shí)現(xiàn)不僅會對細(xì)胞和整體產(chǎn)生作用,同時(shí)也會受到來自細(xì)胞內(nèi)外的調(diào)控,因此,在正常或病理狀態(tài)下的整體動物中進(jìn)行基因功能的評價(jià)和確證研究更為有效。5 總結(jié) 在當(dāng)代藥物開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)和選擇合適的藥物靶點(diǎn)是藥物開的第一步,也是藥物篩選及藥物定向合成的關(guān)鍵因素之一。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對藥物和疾病的認(rèn)識也都達(dá)到了新的高度，基因克隆技術(shù)將會在藥物發(fā)現(xiàn)以及藥物應(yīng)用方面更加廣泛，也會得到更好的發(fā)展。參考文獻(xiàn)：【1】唐炳華.分子生物學(xué).北京：中國中醫(yī)藥出版社,2011.5【2】HanashSM,Madoz2GurpideJ,MisekDE1Leukemia,2002,16（4）：478-485【3】IlagLL,NgJH,Bes