第二章2種子的擴(kuò)大培養(yǎng)2006

1、2019/8/16http:/ kc/fjgc 1 2019/8/16http:/ kc/fjgc 2 2019/8/16http:/ kc/fjgc 3 第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng) 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與任務(wù) 種子制備與培養(yǎng) 種子質(zhì)量控制 2019/8/16 種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干 燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化 后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最 終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培 養(yǎng)物稱(chēng)為種子。 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念: 一、一、 二、種子擴(kuò)培的目的 ? 接種量的需要 ? 菌種的馴化 ? 縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平 ? 三、種子的要求及任務(wù)： ? 總量

2、及濃度能滿(mǎn)足要求 ?生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體 ?活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后，能夠迅速生長(zhǎng) ?無(wú)雜菌污染 四、種子制備的過(guò)程 。 實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、 搖床等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠(chǎng)這些培養(yǎng)過(guò)程一 般都在菌種室完成，因此形象地將這些培養(yǎng)過(guò)程 稱(chēng)為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。 生產(chǎn)車(chē)間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般 在工廠(chǎng)歸為發(fā)酵車(chē)間管理，因此形象地稱(chēng)這些培 養(yǎng)過(guò)程為生產(chǎn)車(chē)間階段 種子罐級(jí)數(shù)的確定 谷氨酸： 搖瓶 小罐（一級(jí)種子）二級(jí)發(fā)酵 青霉素： 小罐（一級(jí)種子 ）中罐（二級(jí)種子）三級(jí)發(fā)酵 制備種子逐級(jí)擴(kuò)培的次數(shù)，一般由菌絲體培養(yǎng)開(kāi) 始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠(chǎng)從第一級(jí)種子罐開(kāi)

3、始 計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù) ? 2019/8/16http:/ kc/fjgc 13 發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù) ? 級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響 ? 級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一 般2-4級(jí)。 ? 在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要 的一個(gè)方面 ? 1、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備 斜面菌種 一級(jí)種子培養(yǎng) 二級(jí)種子培養(yǎng) 培養(yǎng)基： 蛋白胨 1% ， 牛肉膏1% ， 氯化鈉 0.5% 瓊脂 2% ， pH 7.0-7.2 培養(yǎng)條件： 32， 生長(zhǎng)18-24 小時(shí) 葡萄糖2% ， 尿素0.5% ， 玉米漿 2.5% ， K 2HPO4 0.1% 32搖瓶 培養(yǎng)12小時(shí) 水解糖2.5%

4、 ， 尿素0.5% ， 玉米漿 2.5% ， K 2HPO4 0.1% 32種子罐 培養(yǎng)7-10 個(gè)小時(shí) 2、青霉素生產(chǎn)的種子制備 斜面孢子 大米孢子 一級(jí)種子 二級(jí)種子 發(fā)酵 ? 培養(yǎng)基： 甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培養(yǎng)條件： 25、 7天, 濕度50% 大米 氮源（玉米漿） 25、 7天， 控制濕度 葡萄糖 玉米漿 27， 40小時(shí) 27、 10-14 小時(shí) 葡萄糖 玉米漿 ?三 、種子培養(yǎng)方法 1、表面培養(yǎng)法 （surface culturing ）：是一種 好氧靜置培養(yǎng)法。 2、固體培養(yǎng)法(solid culturing) ： 3、液體深層培養(yǎng)(liquid submerged cu

5、lturing) 固體培養(yǎng)又分為淺盤(pán)固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)， 統(tǒng)稱(chēng)為曲法培養(yǎng)。它起源于我國(guó)釀造生產(chǎn)特有的 傳統(tǒng)制曲技術(shù)。其最大特點(diǎn)是固體曲的酶活力高。 3 3、液體深層培養(yǎng)(liquid submerged culturing) (liquid submerged culturing) 液體深層種子罐從罐底部通氣，送入的空氣 由攪拌漿葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這 種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對(duì)于由氣液 界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來(lái)講，稱(chēng) 為深層培養(yǎng)法。 （一）影響孢子質(zhì)量因素 1、培養(yǎng)基：產(chǎn)地、品種、加工方法、用量 四、影響種子質(zhì)量的因素 2、溫度和濕度 3、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)

6、間 4、接種量 培養(yǎng)物的選擇原則 在生產(chǎn)車(chē)間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。 ? 縮短發(fā)酵時(shí)間 ? 有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果 菌絲體比孢子要有利： ? (二)影響種子質(zhì)量因素 1、培養(yǎng)基選擇的原則 目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng) 首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所 以營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。 在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近于 發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個(gè)方面的原因: 一是成本 二是馴化 ? 例：檸檬酸發(fā)酵 ? 以蔗糖為原料 成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K 2HPO4 0

7、.03% MgSO 4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 瓊脂 2% ? ? 以薯干粉為原料 成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 薯干粉 10% 22-28% (NH 4)2SO4 0.5% 瓊脂 2% ? ?2、培養(yǎng)條件：溫度、 ? 攪拌（需氧量） ? 補(bǔ)料 ? 3、種齡 （1）種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)始移入下一級(jí)種 子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。 種齡短：菌體太少；種齡長(zhǎng)：易老化。 （2）選擇原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃 度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。 ? 舒琴， 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 2004 鏡檢：24小時(shí)多個(gè)桿菌首尾相連成線(xiàn)形，處于繁殖旺盛期 3

8、0小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)芽孢 ? 4、接種量 移入發(fā)酵罐的種子液的體積 接種量 接種后發(fā)酵罐培養(yǎng)液的體積 過(guò)大過(guò)小都不好，最終以實(shí)踐定，如大多數(shù)抗生素為 7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。 雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。 倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。 ? 接種量對(duì)菌體形態(tài)和產(chǎn)亞麻酸的影響 楊博， 中國(guó)油脂，2002 2002 亞麻酸是一種人體必需多價(jià)不飽和脂肪酸，它是人體亞麻酸是一種人體必需多價(jià)不飽和脂肪酸，它是人體 前列腺素的前體物質(zhì)，在預(yù)防與治療心腦血管疾病、糖尿病前列腺素的前體物質(zhì)，在預(yù)防與治療心腦血管疾病、糖尿病 治療、增強(qiáng)免疫力、抗癌和保護(hù)皮膚等方面具有重要的生理治

9、療、增強(qiáng)免疫力、抗癌和保護(hù)皮膚等方面具有重要的生理 功能。因發(fā)酵法生產(chǎn)功能。因發(fā)酵法生產(chǎn)亞麻酸與從天然植物提取相比具有一亞麻酸與從天然植物提取相比具有一 系列優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn)系列優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn)亞麻酸成了當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)。亞麻酸成了當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 亞麻酸發(fā)酵一般是采用絲狀真菌來(lái)進(jìn)行，絲狀真菌的亞麻酸發(fā)酵一般是采用絲狀真菌來(lái)進(jìn)行，絲狀真菌的 形態(tài)往往對(duì)發(fā)酵有較明顯的影響，而絲狀真菌發(fā)酵形態(tài)往往對(duì)發(fā)酵有較明顯的影響，而絲狀真菌發(fā)酵亞麻酸亞麻酸 時(shí)菌絲體形態(tài)的不同對(duì)發(fā)酵的影響很少有報(bào)道。時(shí)菌絲體形態(tài)的不同對(duì)發(fā)酵的影響很少有報(bào)道。 ? 采用被孢霉進(jìn)行亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響菌絲體 ? 本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進(jìn)行亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明 顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和 亞麻酸產(chǎn)量。 ? ? 不同接種量影響菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵 ? 發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵指數(shù)明顯提高 發(fā)酵后期菌體自溶明顯，影響提煉收率 ? 20%種子罐10%發(fā)酵罐前期發(fā)酵液效果最好 ? 5、種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： ?細(xì)胞或菌體濃度 ?形態(tài) （生長(zhǎng)處于某個(gè)階段、均勻等等） ?生化指標(biāo)：C、N、P的含量，pH ?產(chǎn)物生成量 ? 酶活 ?無(wú)污染 ? ?6、種子異常分析 ?發(fā)育異常：過(guò)快或過(guò)慢 ?菌絲結(jié)團(tuán)：攪拌、接種量 ?菌絲粘壁：攪拌、泡沫、裝料系數(shù)