蛋白質各種定量方法的優(yōu)缺點的比較

1、蛋白質各種定量方法的優(yōu)缺點的比較1蛋白質的常規(guī)檢測方法1.1 凱氏（Kjeldahl）定氮法一種最經典的蛋白質檢測方法。原理：樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化,含氮有機物分解產生氨,氨又與硫酸作用變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質含量。優(yōu)點：范圍廣泛、測定結果準確、重現(xiàn)性好缺點：操作復雜費時、試劑消耗量大1.2 雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質檢測。原理：雙縮脲（NH3CONHCONH3）是 3 分子的脲經180左右加熱，放出1分子氨后得到的產物。 在強堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅形成紫色絡合物（肽

2、鍵中的氮原子和銅離子配價結合），稱為雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，因此可用來測定蛋白質含量。測定范圍：110mg（有的文獻記載為120mg）優(yōu)點：較快速，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近缺點：靈敏度差； 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。1.3 Folin-酚試劑法原理：Folin-酚法的原理與雙縮脲法大體相同，利用蛋白質中的肽鍵與銅結合產生雙縮脲反應。同時也由于Folin-酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸試劑被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深藍色的鉬藍和鎢藍的混合物。在一定的條件下,藍色深度與蛋白的量成正比，由此可測定蛋白質的含量。 測定范

3、圍：20250ug優(yōu)點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效缺點：費時，要精確控制操作時間； Folin -酚法試劑的配制比較繁瑣,且酚類和檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油、還原劑(二硫代蘇糖醇、巰基乙醇)、EDTA和脲素均會干擾反應。1.4 紫外吸收法原理：蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在 280nm 處具有紫外吸收， 其吸光度與蛋白質含量成正比)。此外，蛋白質溶液在280nm的吸光度值與肽鍵含量成正比， 利用一定波長下蛋白質溶液的吸光度值與蛋白質濃度的正比關系可以測定蛋白質含量。優(yōu)點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收。 缺點：測定蛋白質含量的

4、準確度較差，專一性差；干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現(xiàn)較大的干擾。定氮法、雙縮脲法、Filon-酚試劑法和紫外吸收法為常用的4種古老的經典方法。1.5 考馬斯亮藍法原理：染料考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）及芳香族氨基酸殘基相結合，使染料最大吸收峰的位置由465nm 變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色，在595nm下測定的吸光度值與蛋白質濃度呈正比。優(yōu)點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。缺點：由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同

5、,因此用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。2. 蛋白質的電化學檢測方法2.1蛋白芯片技術原理：將各種蛋白質有序地固定于載玻片等各種介質載體上成為檢測的芯片，然后用標記特定熒光物質的抗體與芯片上的蛋白質相匹配結合，抗體上的熒光將指示對應的蛋白質及其表達數(shù)量。優(yōu)點：快速、低成本2.2 電化學免疫傳感器原理：電化學免疫傳感器是基于抗原抗體反應，可進行特異性的定量分析的自給式的集成器件， 抗原、抗體是分子識別元件，且與電化學傳感元件直接接觸，并通過傳感元件把某種化學物質濃度信號轉變?yōu)橄鄳碾娦盘枴?. 蛋白質的分子生物學檢測方法3.1鄰位連接技術原理：首先將不同的 DNA 單鏈分別與蛋白質識別分子相結合

6、,形成PLA 探針，經過類似酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）中的溫育過程，2條含有不同DNA 序列的PLA探針會同時結合到同一個待測蛋白質分子上。此時，2 條探針的DNA尾部便在空間上緊密靠近。在過量的互補連接序列和NDA連接酶的作用下，2 條探針DNA尾部的游離 5 端和3 端與互補序列雜交并發(fā)生連接反應，形成一個環(huán)狀的蛋白質-蛋白識別分子-單鏈DNA復合物。該復合物量的多少，完全取決于樣品中待測蛋白質分子的量，故可用于蛋白質的定量分析。優(yōu)點：檢測靈敏度高、檢測特異性強、樣品損耗低、操作簡單、檢測設常見3.2 核酸適體原理：直接在核酸適體上共價修飾熒光基團，利用它與靶分子結合時熒光信號的變化實現(xiàn)

7、對靶分子的檢測。修飾有熒光熄滅基團的核酸適體探針通過靜電作用與陽離子熒光共軛聚合物結合，導致后者熒光熄滅，當加入靶蛋白后，核酸適體探針與其特異性結合，熒光熄滅基團與陽離子熒光共軛聚合物遠離，聚合物熒光信號得以恢復。優(yōu)點：檢測限低，檢測線性范圍廣3.3 電泳法原理：電泳法,就是指帶電荷的供試品（如蛋白質、核苷酸等）在惰性支持介質（如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，由于各組分之間的移動速度不同，使各組分分離成狹窄的區(qū)帶，并用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量。優(yōu)點：操作簡便、快速、樣品用量少、高自動化。缺點：

8、存在核酸、多糖、脂類等干擾分子，影響檢測結果。3.4 二甲酸喹啉（BCA）法原理：在堿性溶液中，蛋白質將Cu2+還原成Cu+，BCA與Cu+結合形成穩(wěn)定的藍紫色復合物，在562nm處具有最大吸收峰，在一定條件下，此復合物的吸光度與蛋白質濃度成正比。優(yōu)點：試劑單一，終產物穩(wěn)定，除對還原性糖類的干擾敏感外，對其他物質包括常用蛋白質增溶的表面活性物質如SDS等均無影響。缺點：反應時間長且蛋白質也會發(fā)生不可逆的變性。4. 免疫法4.1 免疫擴散法原理：環(huán)狀免疫單擴散法，將一定量的抗體（一般常用單價抗血清）與含緩沖液的瓊脂糖凝膠混勻鋪成適當厚度的凝膠板，再把抗原滴進凝膠板的小孔中，在合適的濃度和濕度環(huán)境

9、中，經過一定的時間，抗原由小孔向四周擴散（呈輻射狀），與已沉勻在瓊脂糖凝膠中的抗體相互作用。當抗原擴散到一定的距離，并見抗原抗體的濃度比例合適時，形成濃沉淀環(huán)，這一沉淀是一種抗原抗體復合物?？贵w的濃度一定，抗體向瓊脂糖凝膠擴散形成的沉淀不再增大，這時沉淀環(huán)的大小(面積)與抗原濃度在一定范圍內呈線性關系，這樣即可定量測定抗原物質-待測樣品中蛋白質的含量。 雙向擴散法：一定濃度的瓊脂糖（或瓊脂）凝膠是多孔的網狀結構，大分子物質可自由通過，這種分子的擴散作用可使分別在兩處的抗原和相應抗體相遇，形成抗原-抗體復合物，比例合適時出現(xiàn)沉淀，沉淀的特征與位置取決于抗原分子量的大小、分子結構、擴散系數(shù)和濃度。

10、優(yōu)點：操作簡單缺點：精確度不高精品 Word 可修改 歡迎下載 親愛的用戶：煙雨江南，畫屏如展。在那桃花盛開的地方，在這醉人芬芳的季節(jié)，愿你生活像春天一樣陽光，心情像桃花一樣美麗，感謝你的閱讀。1、最困難的事就是認識自己。21.4.274.27.202122:3422:34:534月-2122:342、自知之明是最難得的知識。二二一二二一年四月二十七日2021年4月27日星期二3、越是無能的人，越喜歡挑剔別人。22:344.27.202122:344.27.202122:3422:34:534.27.202122:344.27.20214、與肝膽人共事，無字句處讀書。4.27.20214.27.202122:3422:3422:34:5322:34:535、三軍可奪帥也。星期二, 四月 27, 2021四月 21星期二, 四月 27, 20214/27/20216、最大的